聚丙烯酰胺凝胶电泳(圆盘电泳)
实验概要
本实验介绍了聚丙烯酰胺凝胶电泳(圆盘电泳)的操作流程。
实验原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳是利用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)与N，N亚甲基双丙烯酰胺(N，Nmethylene bisacrylamide，Bis)在催化剂的作用下，聚合成大分子凝胶后，加样，再进行电泳的一种方法。聚丙烯酰胺凝胶是一种网状的立体结构，其孔径大小可以控制，用这种凝胶进行电泳，同时具有电泳和分子筛的双重作用。当样品通过凝胶进行电泳时，便可依据样品中各种分子的电荷不同与分子量大小或构型的差异而将各成分分开。由于聚丙烯酰胺凝胶化学性质稳定，很少带有侧基，吸附作用与电渗作用均小，所以具有很高的分辨率与敏感性。
主要试剂
1. 20%的单体母液：
丙烯酰胺 19.6 g
N，N亚甲基双丙烯酰胺0.4 g
加蒸馏水至 100 ml
2. TrisEDTA缓冲液(pH值6.8)：
0.5mol/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)60.57 g
0.04mol/L EDTA (乙二胺四乙酸) 11.7 g
加蒸馏水稀释至 100 ml
3. β二甲基胺基丙腈(DMPN)液：
取原液(4℃保存)或用前稀释至50%浓度
4. 10%过硫酸铵溶液：
过硫酸铵 0.5 g
加蒸馏水 5 ml
注：需在使用时配制。配制后保存于4℃。
5. 0.025mol/L pH值9.0硼酸缓冲液(电泳槽用)：
母液
硼酸 49.48 g
硼砂 30.512 g
加蒸馏水至 1 000 ml[HJ]
使用液：取母液90ml加蒸馏水至1 440ml即成。
实验步骤
1. 样品处理：取待检样品与标准品(对照)各0.1ml，加入0.5%溴酚蓝指示剂各1滴，再加入25%蔗糖各0.1ml，混合均匀备用。
2. 凝胶管制备：取20%单体母液3.6ml，TrisEDTA缓冲液(pH值8.8)12ml，加7ml蒸馏水混匀，再加入βDMPN液0.05ml，10%过硫酸铵0.15ml，混匀，于5min内完成。将0.5×7.5cm两端开口的小玻璃管，一端用橡皮薄膜包扎封闭，插入有孔的橡皮塞孔洞中，将上述混合液立即装入小玻璃管内，上端留10cm空处，再加入蒸馏水至满，注意勿产生气泡。于室温下静止30min，使之聚合成凝胶。
3. 加样：用毛细管吸去凝胶管上端的蒸馏水，缓缓加入已处理的样品于凝胶柱面上，每种样品加1管。每管留0.5ml空处，再加入蒸馏水至满。操作过程不得产生气泡和冲击凝胶面。
4. 电泳：除去凝胶玻管下端之橡皮薄膜，将凝胶玻管连同有孔橡皮塞一起插入电泳槽的孔洞中，并作好标记，其余未插凝胶管之孔洞以无孔胶塞填塞。于上、下电泳槽中各加入0.025mol/L pH值9.0硼酸缓冲液，液面应将凝胶管两端淹没。以正负极分别联接下槽与上槽的电极插座，接通电源进行电泳。起始电流应小，用1mA/管，待示踪染料到达分离胶后，将电流增加到2～5mA/管。在考虑到电流的同时，也要考虑到电压，开始用100～150V，待样品进入到分离胶时，电压可升到250V。一般如用4mA/管电流，于20℃电泳约需40min。也可根据溴酚蓝指示剂移动下降情况，掌握电泳时间。当指示剂下降到距凝胶玻管下口约0.5cm时，关闭电源，停止电泳。
5. 剥胶：电泳毕，取出凝胶玻管，以带有8～10cm长针头的注射器吸取水，将针头徐徐插入凝胶玻管内壁与凝胶柱间，边推进，边注水，待针头快到管底时，沿原路退出针头，另换一处重复上述操作，反复几次，凝胶柱即可与玻管剥离。此时，于管的一端稍稍加压，即可将凝胶柱由玻管内挤出。
6. 染色处理：将凝胶柱浸泡于0.5%氨基黑10B染色液中，浸染1h，取出凝胶柱，用水冲去柱上沾附之染液，放于7%冰醋酸中脱色，约一天，可脱到背底无色。然后将凝胶柱浸于2%冰醋酸之细玻管中保存。也可作电泳染色和脱色。即在电泳后不取下凝胶玻管，而将上、下槽缓冲液换成7%冰醋酸，并于凝胶玻管内加入氨基黑10B染料(加入少许蔗糖，避免染料与醋酸混合)，电泳时，染料可自动将蛋白各成分染色并经醋酸脱去背底颜色。
7. 结果
对电泳后的结果，可用下列方法进行判定：
1) 定性分析：以凝胶染色的区带图样与标准品图样进行对比鉴定。
2) 定量分析：可选用以下方法：
a. 进行直接光密度扫描；
b. 把凝胶切成等距的薄片，洗脱，用生物化学方法作洗脱液的比色测定；
c. 放射性同位素法，在样品中加入标记同位素，如3H、14C等，电泳后，用计数器测量放射活性，计算结果。
注意事项
1. 样品的离子强度、pH值尽可能与浓缩胶液相同，如含大量盐时，应经透析除盐。样品的蛋白浓度以1mg/ml为宜。
2. 丙烯酰胺和N，N亚甲基双丙烯酰胺的贮存液，会因水解后产生丙烯酸与氨而失效，也可因水解而变质。故应装在棕色瓶中，冰箱保存可以延缓失效期。最好每月配制一次。一般应测定其pH值(4.9～5.9)，过低则难以聚合。
3. 过硫酸铵溶液最好当天配制，冰箱保存，最多不超过1周。
4. 凝胶应充分聚合，室温低时，可适当延长聚胶时间，在37℃温箱中可促进凝胶聚合。凝胶柱面应整齐，在操作过程中，不要产生气泡，否则电泳后区带不整齐。
5. 电泳中应保持电流稳定，避免电流强度过高，而产生大量的热，使分离失败。
6. 缓冲液可再行使用，但应注意上下槽缓冲液不能混合或互换。因下槽中混入了催化剂及氯离子，如将下槽的缓冲液用于上槽，则影响电泳。
7. 如凝胶浓度较高，剥胶困难时，可用10%甘油水溶液代替水注入。
8. 丙烯酰胺和N，N亚甲基双丙烯酰胺这两种单体，可引起神经中毒与刺激皮肤粘膜的作用，应注意自身防护。
9. 在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入适量(如0.1%)的十二烷基硫酸钠(SDS)为助溶剂，可以测定生物大分子的分子量，研究复合蛋白质的单体性质，获得明晰的电泳图谱。
