Native-PAGE(非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)原理、方法步骤与...
Native-PAGE(非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)原理、方法步骤与常见问题
问题和解答
1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时预电泳是怎么回事的？预电泳时要加6×DNA上样缓冲液吗？电泳1－2小时再加结合反应产物吗？
预电泳是除去凝胶中没有聚合的单体和双体和聚合引发剂，提高分辨率，不加任何物质，一般３０－６０分钟后加样电泳。
2. 银染的步骤是什么？银染的关键因素是什么？
步骤是：
（1） 固定：10%冰乙酸min。
（2） 清洗：双蒸水冲洗凝胶次，每次1min。
（3） 染色：染色液（1g硝酸银，.5mL37%甲醛，1L双蒸水。现配）染色30min。
（4） 清洗：迅速洗凝胶次。
（5） 显影：30g碳酸钠，1.5mL37%甲醛，200uL 10mg/L硫代硫酸钠。显影至清晰带纹出现。
成功银染的关键因素包括：
（6） 用超纯水（比如，NANOpure或Milli-Q纯化）或者是双蒸水作银染。
（7） 用提供的碳酸钠或者ACS试剂级的碳酸钠。
（8） 在染色后，水清洗所用时间的长短很重要，用不超过5-10秒的时间清洗胶，然后放入显色溶液中，一般在水里浸一下就好。
（9） 甲醛和硫代硫酸钠（ul/1ml）在使用前，及时加入到显色液中。
（10） 在使用前及时配染色液。
3. 变性PAGE的上样缓冲液配方？如何准备上样的蛋白？是将细胞用超声破碎,还是用细胞裂解液,大多细胞裂解液中均含有SDS,不知有没有用于非变性
PAGE 的裂解液.具有操作步骤是什么?
非变性的PAGE buffer就是0.5xTBE,上样缓冲液可以用普通的loading buffer，含有Tris,溴芬兰以及甘油即可，甘油是主要的沉淀作用成分。都可以自己
配。细胞超声即可，超声后离心取上清.也有配NATIVE-PAGE gel所用buffer为1*TBE,用的running buffer也是1*TBE。还有一点就是要在配gel时考虑能使蛋
白多聚体稳定的因素。
4. 做了naive---PAGE没有条带，蛋白质是纯品，分子量很大，怎么回事呢？
因为分子量很大，8%的胶浓度较合适。加样时加个marker，可以检测胶制备是否有问题。银染方法比较灵敏，如果蛋白是一种酶，且可使某种底物显色的话，可以用活性染色试试，更灵敏。
Native-PAGE注意几个问题
1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，蛋白质的迁移率不仅和蛋白质的等电点有关，还和蛋白质的分子量以及分子形状有关，其中蛋白质的等电点是最重要
的影响因子，要根据蛋白质的等电点来选择对应的电泳缓冲系统；
2. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，要注意电压过高引起发热而导致蛋白质变性，所以最好在电泳槽外面放置冰块以降低温度；
3. 蛋白质的分子量较大，则电泳时间可以适当延长，以使目的蛋白质有足够的迁移率和其它的蛋白质分开，反之亦然;
4. 变性样品的离子强度不能太高（I<0.1mM）。调整样品的PH在4.0左右，这对于能否做好非变性样品非常重要。上样BUFFER 中没有SDS之外，加入样品后不能加热.
