冷冻饮品中大肠埃希氏菌 O157 检测
夏天到了，全国各地又进入了“烧烤模式”。4 月 23 日，广州入夏；5 月 14 日，北京入夏；5 月 29 日，上海入夏。下图为中国气象网 8 月 3 日发布的一张高温区域图，红色代表的高温区域占据相当大的比例。
在炎炎夏日中，美味而且清凉的冷饮，可以让大家忘却酷暑炎热。市场上各种品牌的冰淇淋、冰棒、汽水、果汁等产品琳琅满目，极大地丰富了人民的物质生活。但是冷饮的保存需要注意，通常都需要 4℃ 冷藏保存，部分冰品还需要 -20℃ 低温保存。这些冷饮一旦融化后再复冻，里面就有可能会有细菌繁殖。
中国国家标准《GB 2759.1-2003 冷冻饮品卫生标准》对微生物含量做出了具体要求，下表为具体信息：
| 项目 | 菌落总数 （cfu/mL） | 大肠菌群 （MPN/100mL） | 致病菌 |
| 含乳蛋白冷冻饮品 | ≤ 25000 | ≤ 450 | 不得检出 |
| 含豆类冷冻饮品 | ≤ 20000 | ≤ 450 | 不得检出 |
| 含淀粉或果类冷冻饮品 | ≤ 3000 | ≤ 100 | 不得检出 |
| 食用冰块 | ≤ 100 | ≤ 60 | 不得检出 |
大肠埃希氏菌（E.
coli）通常被称为大肠杆菌，这些细菌常寄居在人和动物的消化道，并随粪便排出体外，广泛分布在水和土壤中。大多数肠道杆菌属于正常菌群，当机体免疫力降低或侵入肠道外组织时，成为条件致病菌而引起疾病。肠出血性大肠杆菌（EHEC）是能引起人的出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌。以
O157:H7 血清型为代表菌株。根据相关标准，大肠埃希氏菌 O157 在冷冻饮品中不得检出。
根据相应标准，RephiLe 特别推荐下面的冷冻饮品中大肠埃希氏菌 O157 检测解决方案。检测方案按照国际标准在固体培养基表面分离得到的典型菌落，该菌落能产品吲哚反应以及使 O157 血清产生凝集：
一、仪器
干热灭菌箱和湿热灭菌器；培养箱；PH 计；无菌接种环；移液器；磁性架；旋转混合器；Direct-Pure UP 超纯水系统。
二、试剂
增菌液：mTSB + N（改良胰蛋白胨大豆肉汤 mTSB + 新生霉素溶液）；CT-SMAC培养基；营养琼脂；胰蛋白胨培养基；吲哚反应培养基；抗大肠埃希氏菌 O157 免疫磁珠；改良蛋白胨缓冲液，0.01 mol/L，PH 7.2；生理盐水；Kovac's 靛基质试剂；大肠埃希氏菌 O157 抗血清。
三、试验方法
1、取样
取 (x) g 或是 (x) mL 样品加入 9(x) g 或是 9(x) mL mTSB + N 增菌液中，于41.5℃培养，最后的样品与 mTSB + N 体积比为 1:10。
2、增菌
将上述增菌液于 41.5℃ 培养 6 h，随后再培养 12 - 18 h，总计培养 18 - 24 h。6 h 培养后进行随后的免疫技术分离以及选择性培养基上接种得到的假阳性结果在 18 h 培养后可能得到的是阴性结果。
3、免疫磁珠分离(IMS)
混合增菌液，将食物的残渣弃去。
取一个离心管，加入 20 μL 已准备好的平衡到室温的免疫磁珠微粒。取 1 mL 增菌液的上清液，避免吸入实物杂质或是脂肪加入到离心管中。在旋转混合器上以 12 - 20 r/min 的速率将混悬液混合 10 min。
把离心管放置在磁性架上，将磁珠聚集起来，确保避免磁珠微粒吸附在管壁上。打开管盖（离心管保持在磁性架上），使用无菌巴斯德吸管把液体从管子的底部慢慢吸起来，每个样品均使用一个新的吸管。加入 1 mL 无菌缓冲清洗液盖上管盖，将离心管从磁性架上取下，正反颠倒混匀后放回磁性架。
重复上述清洗过程数次。
最后加入 100 μL 无菌缓冲清洗液使磁珠重新悬浮，然后从磁性架上取下。
4、接种
吸取 50 μL 悬浮液接种到预先干燥的 CT-SMAC 上，使用无菌接种环划线以得到分离良好的单菌落。37℃ 培养 18 - 24 h。在 CT-SMAC 平板上，典型菌落形态为透明或是接近无色，菌落周围出现黄棕色，菌落直径为 1 mm。
5、接种
5.1 选择菌落
每块平板上选择 5 个典型菌落，如果典型菌落少于 5 个则全部选择。将典型菌落在营养琼脂上分离纯化。37℃ 培养 18 - 24 h。需选用纯菌落进行鉴定。
5.2 生化鉴定：吲哚反应
挑取一个纯化的单菌落于胰蛋白胨培养基中。37℃ 培养 24 h。加入 1 mL Kovac's 靛基质试剂，室温下放置 10 min。出现红色环为阳性反应，出现黄色环为阴性反应。
5.3 血清确诊
只有吲哚反应阳性的菌落需要进行大肠埃希氏菌 O157 血清反应。
滴一滴生理盐水在一块干净的玻片上，用接种环在营养琼脂上挑取一个菌落于生理盐水上，使菌落在生理盐水里均匀分散，晃动玻片 30 - 60 s，在黑色背景下进行观察。如果菌悬液形成块状，则该菌株是自动凝集菌株，不能进行特定抗血清的测试。
挑取营养琼脂上的纯菌落在玻片上，悬浮于生理盐水中，滴加一滴大肠埃希氏菌 O157 抗血清。如果在 1 min 内出现凝集，则该反应为阳性。
菌落为吲哚阳性，并满足 O157 抗血清或是 O157：H7 抗血清阳性。菌落即可鉴定为大肠埃希氏菌 O157。
6、质量控制
6.1 质量控制菌株
从国家菌种保藏中心可以得到不具毒性的大肠埃希氏菌 O157 菌株，该菌株可以用于培养基和血清的质量控制。
6.2 培养方法
为了测试实验室能力以及按照该国际标准描述的测试方法测试培养基对于低含量的大肠埃希氏菌 O157 的检出能力，准备一个低浓度不含致病性的大肠埃希氏菌 O157 参考样品和一个添加大量其他大肠埃希氏菌的样品进行平行测试。
7、检出限与报告限
按照结果解释，在指定的质量或是体积样品中，根据本方法检出或是未检出大肠埃希氏菌 O157。
在包括大肠埃希氏菌 O157 在内的致病菌检测及菌落总数检测实验中，培养基配制、试剂配制等步骤需要用到纯水。RephiLe 特别推荐 Direct-Pure UP 一体化超纯水系统。Direct-Pure UP 是一款以自来水为进水，同时生产 RO 纯水和超纯水的超纯水系统。Direct-Pure UP 生产的超纯水经双波长紫外灯杀菌并分解有机物、0.22 μm 终端滤器截留后，超纯水中细菌含量小于 1 cfu/mL，可以用来配制培养基和试剂溶液；RO 纯水可以用来清洗实验器皿及水浴。Direct-Pure UP 可以选配取水手柄，RephiLe 独有ZL的取水内置电阻率检测仪，可以实时反映取水点的真实水质；手柄连线长达 3 米，远程取水轻松自由，方便舒适。RephiLe 还可以提供纯水系统的验证服务，帮助用户完成符合 ISO、GMP、GLP 的系统验证，满足实验室对于相关认证活动的要求。确保您在使用中安心，放心，用水无忧。
