植物组织培养技术知识汇总（二）
三、生根
生根是获得完整植株的一个关键。通过侧芽和不定芽途径产生的芽长成嫩枝后(此时的嫩枝叫试管苗)，必须诱导生根才能移植。促使试管苗生根的方法通常有两种。一种是在固体培养基上诱导生根。当试管苗长到2～3厘米高时，将它从基部切下，转移到只含0.2～0.5毫克/升的萘乙酸或吲哚丁酸的固体培养基上生根。
另一种是浸泡的方法，将切下的无根试管苗泡在含有高浓度生长素溶液中，生长素浓度为100毫克/升左右，浸泡时间从几小时到1天，然后取出接种于不加任何激素的MS培养基上，十天左右即可生根。
以上两种方法，在更换培养基后，经过几天，都要将试管苗的瓶口打开，上盖1～2层纱布，以便于通气。并要适当加强光照，以增加试管苗的自养能力。
四、移栽
当试管苗的根原基突起或形成几毫米长的短根时，将其取出，洗去琼脂，载入有少量营养的人工基质中。移栽后，保持高湿度，避免阳光直射和过大的温度波动，经过一段逐步锻炼的过程，再定植到土壤中。
在移栽过程中，试管苗的环境条件发生了剧烈的变化，其本身又从异养变到自养，叶的光合作用和根的吸收作用需要逐渐发展。因此移栽时要小心控制，使试管苗逐步锻炼，最终能在土壤中生活。
第六部分 植物组织培养苗之污染来源与污染鉴定
一、在组织培养中污染来源
1. 植物本身具有：
(1)植物病原菌 有些作物的病害已被透彻研究，因此在大量繁殖时，可立即检查出来，但有些则否，造成若有污染时，不知来源为何。
(2)和植物有关的菌类 有修植物本身便会和一些菌种共生，或是寄生于植物内部。
2. 植物所带入的污染：内在污染源
许多植物表面或大气中生存的微生物，可经由植物自然的开口或伤口进如植物内部，而有一些兼性腐生菌或绝对寄生菌，可藉由载体或是拥有一些侵入的机制侵入植物内部，依其存在的地方分为
1. 细胞内-inter 2. 细胞间隙-interacellular 种类有：virus病毒、viroids类病毒、prokarytoes原核生物、fungi真菌、柔膜纲(ex:mite)、立克次体。
3. 操作室：外在污染源
在组织大量培养下，除了植物本身外，大部分最有可能的污染来源便是来自操作室。依其可能原因分析为：
(1)空气
在操作室中，未过滤空气带有大量的微生物，随者操作人员或植株接触时，而污染培养皿。故在国外对于操作室内空气的清洁度分为四种等级：
ClassⅠ.没有容易培养的微生物，和作物之主要病原菌
Ⅱ.没有容易培养的微生物，和作物特殊病原菌
Ⅲ.没有容易培养的微生物
Ⅳ.未做检测
(2)不完全的灭菌设备或技术
因为使用灭菌不完全的设备或是技术，而导致植株或培养皿的污染，例如：有些酵母菌，可避免酒精消毒，还有一些会产生内孢子，而避免火焰消毒。
(3)人员
在整个操作室内，人员可说是最大的带菌者，其不管在毛发或是衣服等，都隐藏属不清的菌。在进入操作室前，最好能将作业人员清洁处理，然后换上脱鞋，或是将尘土去掉。
(4)细缝的存在 因为若操作室有细缝的存在，则造成外果气体直接流入，使得空气中菌数增加。
(5)操作台上的滤网不干净 因为使用过久，或不当保养，而造成滤网坏掉，而产生更多的污染。
(6)蹒及蓟马的存在 此为珠形网，具有活动能力，能到处跑来跑去。因此常造成散乱的污染。
4.栽培过程污染 在栽培室，组培瓶外和外界气体交换时，亦会有污染进入。污染机率取决于空气中带菌密度与组培瓶空气交换率。
二、污染的种类及形式
1. 污染的形成 依据污染的来源，可将污染分为三个形式：
a.由植物内部或病原菌所造成的污染 植物内部或病原菌所造成的污染，所呈现是系统性，及从stageo~stage4中都可发现，而且占有一定的百分比。
b. 在制造时所造成的污染 如因蹒或是空气中的关系造成的污染，其所表现的方式是散乱(random)性非系统性，且不集中于某一地方，占的百分比也不一定，是机率性。
c. 技术上的失误 其呈现方式有一定性，例如由此工作台所生产得植株都被污染，表现为带状性，可用卷标方式来追踪，以进而改善。
2. 污染的来源分类
A、污染的种类，以总体来说可分为下列几种：
a.病毒(virus)-常存在植物内部。 b.(viroids)常存在植物内部 c.细菌-在组织培养中又分依其来源和所在地方分类如下：
(a) phlem-eimited生长于韧皮部
xylem-eimited生长于木质部
(b)植物病原细菌
(c)空气中存在的细菌，但因植物有伤口，或是营养丰富的地方，可分为植物表面的细菌或植物内部的细菌。
例如：Bacillus spp.可抗热，在不完全灭菌的玻璃器皿中可发现。
(d)菌质体 是一种像细菌的微生物，但是本身没有细胞壁，可以在培养基培养，亦可用特殊的抗生素(四环霉素)抑制其生长。其种类有microplasm与spiroplasm。
(e)真菌
在植物病害中，真菌所引起的病害特别多且严重，且因其会产生孢子，所以会随着空气飘散。一旦落于适当的环境下，一粒小小的孢子便会扩大成一个菌落，污染整个组织培养瓶。例如常见的酵母菌，其菌落为粉红色，若有其出现，则其污染来源可能来自空气。
(f)蹒或蓟马 此为细小的微生物，具有活动能力，喜欢吃菌丝。在国内使用期限较久的组培场中常出现此问题。
(g)立克次体 目前未清楚其污染方式。
B、以培养难易区分污染源
1. 在培养基中易培养菌类 细菌，真菌，蹒。
2. 在培养基中不易培养的菌类 病毒，类病毒，立克次体，菌质体。
在组织培养过程中，常造成污染或是造成威胁的菌类，称为培养菌类。因常为腐生菌，且营养需求不高(随便吃，随便活)所以常造成成本的增加。而且污染后，常使培养基的pH值降低，洋菜无法凝结，而使植物无法生长或是产生有毒物质或副产品，使得植物生长缓慢，或是干脆就在植物上生长。在培养基上不易培养或是不能培养的菌种，就不会造成太大的威胁。
C、各种菌种其主要传播方式
1. 病毒，类病毒，菌质体-常利用机械或利用有载体传播。
2. 细菌-可经人力，气流或水，及昆虫等传播。
3. 真菌-亦同上，但孢子可经空气传播。
4. 蓟马-同上，具活动力，自由运动，应慎防出现。
D、依其菌落生长出现的快慢区别
1. 可见的菌落在组织培养中。一些易培养的菌类，其生长特性为快速蔓延整个组培瓶。但此种污染可利用工作人员之视觉观察将之侦测出来将之销毁，对后代植株造成威胁不大。
2. 潜藏的菌落-在组织培养中有些不易培养或是在植物内部寄生或共生的菌类或病原菌，在培养时没有表现出来，但是有存在或只有很微弱的表现，但是未被察觉出来。于是便造成了对后代植株的重大威胁及成本的增加。
其污染未明显表现出的原因有下列几项：
a在培养基中含有抗生素，则菌类不易生长。.
b.在培养基中，因植物本身的汁液含有某些特殊的成分例如：单宁酸，因此抑制菌类表现。
c.培养基成分不适合其大量表现，可能因营养需求不同。
c. 本身菌类生长方式不同：
例如病毒为绝对寄生菌，无法在一般培养基中培养。
E、依其植物栖息的地方分为：
1. 植物表面栖息的菌类 如：细菌，真菌。
2. 在植物内部共生寄生的菌类： 如：病毒，类病毒，细菌，真菌，菌质体。
3. 在大气中游移的菌种 细菌，真菌，蹒。
三、污染种类的鉴定方式
1. 针对培养难易菌种鉴定方式
A、针对易培养的菌种：其种类为真菌，细菌
a.就真菌而言，主要是利用显微镜，视其孢子形态、产孢结构、及菌丝有无隔膜、还有细胞壁之形成加以鉴定。目前亦有使用DNA探针加以分析。
b.就细菌而言，则是利用其特殊的生化反应，或是利用选择性的培养基。目前亦有如用fatty acid profiling技术和商业化的test kits加以鉴定。 B、不易培养的菌种，如菌质体，病毒，类病毒。
a.就菌质体而言，主要是观察其在培养基上菌落的形态。
b.病毒而言，分析其核酸的组成与例子的外形。 类病毒因没有套膜，以上两种常利用其DNA有同源性而做探针侦测。
C、病原菌的侦测
利用柯霍氏法来测其病源性。而利用分子诊断，如血清、ELISA、DNA序列、核酸的探针以鉴定种类。
2. 鉴定菌种常用的方式与应用的微生物种类 方法 目标微生物 无种别性 指示培养 所有可培养的细菌 DNA/RNA 萤光染色法 菌质体及有关原核生物 Leaf dip electon microscopy 长条状的病毒，其数目较多者亦适用 电泳 类病毒 有种别性 ELISA 细菌及病毒 PALIAS 细菌及病毒 ISEM 病毒 DNA探针 所有微生物 快速诊断的 kits 细菌 Fatty acid profiling 细菌
第七部分 植物组织培养的应用
快速繁殖优良植物株系
组织培养具有时间短、增殖率高和全年生产等优点，比大田生产快得多。加上培养材料和试管苗的小型化，这就可使有限的空间培养出大量个体。
例如兰花(Cymbidium)、桉树(Eucalyptus)、杨树、秋海棠等植物，用一个茎尖或一小块叶片为基数，经过组织培养，一年内可以增殖到10000～100000株，繁殖速度如此快，说明组织培养对于短期内需要大量繁殖的植物，如引入的优良品种、优良单株、育种过程中优良子代的扩大等，特别有用，而且对一些难以繁殖或繁殖很慢的名贵花卉、果木及稀有植物，同样具有重要意义。
培育作物新品种
用组织培养方法培育作物新品种，已经取得了多方面的成就。例如利用组织培养解决杂交育种中的种胚败育问题，获得了杂种子代，使远缘杂交得以成功;用花药培养和对未传粉的子房进行离体培养，获得了单倍体植株，从而开辟了单倍体育种的途径;通过胚乳离体培养.
获得了三倍体植株，为改良农、林、果树和蔬菜的三倍体育种提供了新的方法;此外还有利用原生质体培养及体细胞杂交进行天然突变系的筛选、外源遗传物质的导入等等。
获得无病植株
作物的病毒病害，是当前农业生产上的严重问题。尤其是营养繁殖的作物，病毒可以经繁殖用的营养器官传至下一代，以致随着作物繁殖代数的积累，病毒不仅绵延不绝，还会日益增多。其结果能使作物退化减产，甚至导致某些品种绝灭。
根据病毒在植物体内分布并不均匀的特点，用生长点进行组织培养，结合病毒鉴定，可以得到无病毒植株。这就可以使植株复壮，并能增加产量。在这方面，马铃薯(Solanum tuberosumL.)、水仙(Narcissus tazatia L. var. chinensis Roem)、苹果、梨(Pyrus)和花椰菜(Brassica oleracea var.bo-trytis L.)等作物，都取得了明显效果。
保存和运输种质
由于有了组织培养方法，就无需再用一代代保存种子的方法去保存种质资源，而可以将植物器官、组织甚至细胞，在低温或超低温条件下进行长期保存。将来一旦需要，就可用组织培养方法迅速进行繁殖。
这样不但大大减少了一代代保存材料所浪费的人力、物力和时间，而且也减少了在保存过程中因管理不善及病虫侵害所造成的损失。另外，由于用很小的空间保存了大量的种质资源，运输时也很方便。
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