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人前列腺素E2(PGE2)ELISA试剂盒使用说明

2020.4.13

产品编号：EH4233
尺寸：48T/96T
特异性：人
范围：31.2-2000pg/ml
灵敏度：<18.75pg/ml
应用：用于定量检测血清，血浆，组织匀浆和其他生物体液中的PGE2。
储存：4℃，6个月
注意：仅供研究使用。

套件组件

Item	Specifications(48T/96T)	Storage
MicroELISAPlate(Dismountable)	8×6or8×12	4℃/-20℃
LyophilizedStandard	1vialor2vial	4℃/-20℃
Sample/Standarddilutionbuffer	10ml/20ml	4℃
Biotin-detectionantibody(Concentrated)	30ul/60ul	4℃
Antibodydilutionbuffer	5ml/10ml	4℃
HRP-StreptavidinConjugate(SABC)	60ul/120ul	4℃(shadinglight)
SABCdilutionbuffer	5ml/10ml	4℃
TMBsubstrate	5ml/10ml	4℃(shadinglight)
Stopsolution	5ml/10ml	4℃
Washbuffer(25X)	15ml/30ml	4℃
PlateSealer	3/5pieces
ProductDescription	1copy

分析原理
该ELISA试剂盒使用竞争性ELISA作为方法。该试剂盒中提供的微量滴定板已经预先涂有PGE2。在反应过程中，PGE2在样品或标准品中在固相支持物上与固定量的PGE2竞争生物素化检测PGE2特异性抗体。过量的共轭和未结合的样品或从平板中洗去标准品，并向每个微孔板中加入HRP-链霉抗生物素蛋白（SABC）好好孵化。然后将TMB底物溶液加入每个孔中。酶底物加入硫酸溶液终止反应，颜色变化用分光光度法在450nm波长下测量。PGE2的浓度然后通过比较样品的OD与标准曲线确定样品。

注意事项
1.为了检验实验操作的有效性和样品稀释比例的适当性，建议使用标准品和少量样品进行试验性试验。
2.打开后和使用前，保持板干。
3.在使用套件之前，旋转管并将所有组件放下管的底部。
4.储存TMB试剂避光。
5.洗涤过程非常重要，不能充分洗涤容易造成误报。
6.对于标准和样品测试，建议使用重复孔测定。
7.在测定时不要让Micro板干燥，因为干板会使板上的活性组分失活。
8.不要重复使用吸头和管子以避免交叉污染。
9.避免将不同批次的试剂一起使用。

所需材料但未提供
1.酶标仪（波长：450nm）
2.37℃培养箱
3.自动洗板机
4.精密单通道和多通道移液枪和一次性枪头
5.清洁管和Eppendorf管
6.去离子水或蒸馏水

手动清洗
丢弃板中的溶液而不接触侧壁。将板拍在吸收性滤纸或其他吸收性材料上。用350ul洗涤缓冲液完全填充每个孔并浸泡1至2分钟，然后从板上吸出内容物，并将板拍在吸收性滤纸或其他吸收性材料上。重复此过程两次，共洗涤三次。
自动清洗
吸出所有孔，然后用350ul洗涤缓冲液洗涤板三次。最后一次清洗后，倒转板，并将板拍在吸收性滤纸或其他吸收性材料上。建议将垫圈设置为浸泡1分钟。
样品采集和存储
收集后立即分离测试样品，然后立即分析（2小时内）。或等分并在-20℃下长期保存。避免多次冻融循环。
血清：将全血样品置于室温下2小时或将其置于4℃过夜，以约1000×g离心20分钟，收集上清液并立即进行测定。血液采集管应该是一次性的，无热原的和非内毒素。
血浆：使用EDTA-Na2作为抗凝血剂收集血浆。在收集后30分钟内，在2-8℃下以1000×g离心样品15分钟。收集上清液并立即进行测定。避免溶血，高胆固醇样本。
组织匀浆：由于溶血血液与检测结果有关，因此必须通过用预先冷却的PBS缓冲液（0.01M，pH=7.4）清洗组织来去除残留的血液。称重后将组织剁碎并在PBS中均质化（体积取决于组织的重量。一般来说，9mLPBS适用于1克组织块。一些蛋白酶抑制剂建议添加到PBS中）用玻璃在冰上均化器。为了进一步破坏细胞，您可以使用超声波细胞破碎器对悬浮液进行超声处理，或将其置于冻融循环中。然后将匀浆以5000×g离心5分钟以得到上清液。
细胞培养上清液：在2-8℃下以1000×g离心上清液20分钟，除去不溶性杂质和细胞碎片。收集清澈的上清液并立即进行检测。
其他生物流体：在2-8℃下以1000×g离心20分钟。收集上清液并立即进行测定。
样品制备：样品应清澈透明，离心除去悬浮固体。

注意：5天内使用的样品可以在4℃下储存，此外，样品必须储存在-20℃（分析≤1个月）或-80℃（分析≤2个月），以避免失去生物活性和污染。溶血样品不适用于该测定。

样品稀释指南
最终用户应估计测试样品中目标蛋白的浓度，并选择合适的稀释因子，使稀释的目标蛋白浓度落在试剂盒的最佳检测范围内。用提供的稀释缓冲液稀释样品，可能需要进行多次试验。必须将测试样品与稀释缓冲液充分混合。并且还应在预试验中制作标准曲线和样品。以下稀释溶液仅供参考：
高浓度（20000-200000pg/ml）：稀释：1：100（即将1μl样品加入99μl样品/标准稀释缓冲液中。）
中浓度（2000-20000pg/ml）：稀释：1：10（即将10μl样品加入90μl样品/标准稀释缓冲液中。）
低浓度（31.2-2000pg/ml）：稀释：1：2（即将50μl样品加入50μl样品/标准稀释缓冲液中。）
浓度极低（≤31.2pg/ml）：无需稀释或以1：2稀释。

试剂制备和储存
使用前将试剂盒置于室温下20分钟
1、洗涤缓冲液：
用去离子水或蒸馏水将50mL浓缩洗涤缓冲液稀释到750mL洗涤缓冲液中。将未使用的溶液放回4℃。如果在浓缩液中形成晶体，可以用40℃水浴加热（加热温度不应超过50℃）并轻轻混合直至晶体完全溶解。使用前应将溶液冷却至室温。
2、标准：
1）.100ug/ml标准溶液：将1ml样品/标准稀释缓冲液加入一个标准管中，将管保持在室温下10分钟并彻底混合。
2）.50ug/ml→1.563ug/ml标准溶液：标记6个Eppendorf管，分别为1000pg/ml，分别为500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml。在每个试管中加入0.3ml样品/标准稀释缓冲液。将0.3ml上述100ug/ml标准溶液加入第一管中并充分混合。将0.3毫升从第一管转移至第二管并彻底混合。将0.3毫升从第2管转移至第3管并彻底混合，依此类推。

注意：最好在2小时内使用标准解决方案。标准溶液应在4℃至12小时。或者将其储存在-20℃至48小时。避免反复冻融循环。
3、生物素标记的抗体工作溶液的制备
在实验前1小时内准备好。
1）.计算工作溶液所需的总体积：0.05ml/孔×孔的数量。
（比总体积多0.1-0.2毫升）
2）.用抗体稀释缓冲液以1：100稀释生物素检测抗体并彻底混合。
（即将1μl生物素标记的抗体加入99μl抗体稀释缓冲液中。）
4、HRP-链霉抗生物素蛋白结合物（SABC）工作溶液的制备：
在实验前30分钟内准备好。
1）.计算工作溶液所需的总体积：0.1ml/孔×孔的数量。
（比总体积多0.1-0.2毫升）
2）.用1：100的SABC稀释缓冲液稀释SABC并彻底混合。
（即将1μlSABC加入99μlSABC稀释缓冲液中。）

分析程序
在将试剂加入孔中之前，在37℃下平衡TMB底物30分钟。稀释样品和试剂时，必须将它们完全均匀混合。建议为每个测试绘制标准曲线。
1.分别在预涂板上设置标准，测试样品和对照（零）孔，然后记录它们的位置。建议一式两份测量每个标准品和样品。在添加标准，样品和对照（零）孔之前洗涤板2次！
2.添加样品和生物素检测抗体：每次加入50μL标准品，空白样品或样品好。在空白孔中加入样品/标准稀释缓冲液。马上加50μL生物素检测抗体工作溶液到每个孔。用Plate密封剂盖住我们提供。轻轻敲打板以确保充分混合。孵育45分钟37℃。（溶液加到微量ELISA板的底部，避免内壁尽最大努力抚摸和发泡。）
3.清洗：吸出每个孔并洗涤，重复该过程三次通过每次填充进行清洗以及使用喷射瓶，多通道移液器的洗涤缓冲液（约350μL），歧管分配器或自动洗衣机。在每一步完全去除液体是良好的表现至关重要。最后一次洗涤后，取出剩余的洗涤缓冲液吸气或倾倒。翻转平板并将其轻轻擦拭干净的吸水纸。
4.HRP-链霉抗生物素蛋白缀合物（SABC）：向每个孔中加入100μLSABC工作溶液。盖上新的Plate封口机。在37℃孵育30分钟。
5.洗涤：重复抽吸/洗涤过程五次。
6.TMB底物：TMB底物添加90μL，每孔。盖上一块新板密封剂。在37℃下孵育约15-20分钟。避光。反应时间可以根据实际颜色变化缩短或延长，但不得超过30分钟。当标准孔中出现明显的梯度时，可以终止反应。
7.停止：每孔加入50μL终止液。颜色立即变为黄色。添加停止溶液的顺序应与基质溶液相同。
8.OD测量：使用a确定每个孔的光密度（OD值）酶标仪设定为450nm。您应该提前打开酶标仪，预热仪器，并设置测试参数。

计算结果
平均每个标准品和样品的重复读数。通过创建标准曲线绘制y轴或x轴上每个标准品的平均OD值与浓度的关系在x轴或y轴上，通过图表上的点绘制最佳拟合曲线。它是建议使用一些专业软件来做这个计算，比如曲线专家1.3或1.4。在软件界面中，将计算标准曲线的最佳拟合方程使用OD值和标准样品的浓度。该软件将计算进入OD样品后的样品浓度。此外，您可以输入相应的拟合方程和OD值将样品加入Excel中得到浓度样本。如果样品已稀释，则从标准曲线计算浓度必须乘以稀释因子。如果样品的OD超过上限标准曲线，应在适当稀释后重新测试。实际浓度是计算浓度乘以稀释倍数。建议使用专业软件曲线专家为1.3，详情请访问：http：//www.fn-test.com/services/software-download/。
注意：如果测量的样品被稀释，则将稀释因子乘以插值的浓度，以获得稀释前的浓度。

摘要
1.在添加标准，样品和对照（零）孔之前洗涤板2次！
2.每孔加入50μL标准品或样品。
3.立即向每个孔中加入50μL生物素检测抗体。
4.在37℃孵育45分钟。
5.吸取并洗涤板3次。
6.每孔加入100μL SABC工作溶液。在37℃孵育30分钟。
7.吸取并洗涤板5次。
8.加入90μLTMB底物。在37℃孵育15-20分钟。
9.加入50μL终止液。立即读取450nm。
10.结果的计算

典型数据和标准曲线
PGE2 ELISA试剂盒的典型标准操作的结果如下所列。该标准曲线在我们的实验室中生成，仅用于演示目的。用户应按自己的实验获得标准曲线。（N/A=不适用）

X	pg/ml	0	31.25	62.5	125	250	500	1000	2000
Y	OD450	1.887	1.111	0.617	0.35	0.217	0.146	0.106	0.067

特异性
该测定法对PGE2的检测具有高灵敏度和优异的特异性。没有观察到PGE2和类似物之间的显着交叉反应性或干扰。
注意：受现有技术和知识的限制，我们很难完成PGE2与所有类似物之间的交叉反应检测，因此，交叉反应可能仍然存在。

复苏
下面列出的基质加入一定水平的PGE2，并通过将测量值与样品中预期的PGE2量进行比较来计算回收率。

Matrix	Recovery range (%)	Average(%)
serum(n=5)	89-103	95
EDTA plasma(n=5)	85-97	91
heparin plasma(n=5)	86-104	93

线性
通过测试掺入适当浓度的PGE2及其连续稀释的样品来测定试剂盒的线性。结果通过计算浓度与预期的百分比来证明。

Sample	1:2	1:4	1:8	1:16
serum(n=5)	85-102%	91-102%	89-101%	86-104%
EDTA plasma(n=5)	85-99%	94-100%	82-98%	84-101%
heparin plasma(n=5)	83-100%	81-97%	90-98%	91-93%

精密度
测定内精密度（测定内的精确度）：分别在一个平板上测试3个具有低，中和高水平Ig的样品20次。
批间精密度（测定之间的精确度）：在3个不同的平板上测试3个具有低，中和高水平Ig的样品，每个平板8个重复。
CV（％）= SD/meanX100
批次内：CV<8％
批次间：CV<10％

稳定性
ELISA试剂盒的稳定性由活性损失率决定。在适当的储存条件下，该套件的失效率在失效日期内低于10％。