大肠杆菌感受态制备与质粒转化
主要试剂
1、LB培养基（灭菌后使用）
胰蛋白胨（bacto-tryptone） 10g/L
酵母提取液（bacto-yeast extract） 5 g/L
NaCl 10g/L
用NaOH调pH至7.0。
2、LB固体平板
每升液体培养基中加入15g琼脂粉，高压灭菌后倒入灭过菌的培养皿中。
3、SOC培养基
20g/L Tryptone
5g/L Yeast extract
0.58g /L NaCl
0.186g /LKCl，灭菌后加入过滤除菌的2M葡萄糖（终浓度为20mM），1M MgCl2（终浓度为10mM）。
5.0.1M CaCl2（灭菌后使用）
6. 0.1M CaCl2+10%甘油
7. 保存于-80℃冰箱的DH5α 或DH10B甘油菌
主要仪器
恒温摇床
冷冻离心机
实验步骤
一 、 热击感受态细胞的制备及热击转化
1、细菌培养
1） 从平板上挑取大肠杆菌（DH5α或DH10B）单菌落，放到LB培养基中。（液体培养基的体积为溶液容积的1/3-1/4为宜）。
2） 在37℃，220 rpm培养10h左右。
3） 中吸取2 mL培养液到装有200 mL LB培养基的三角瓶中，37℃，220 rpm培养2-3hrs，使其OD600达0.5-0.6。
2、细菌收集
将培养液倒入预冷的50 mL离心管中，置于冰上。3000 rpm离心5-10min。
3、感受态制备
1） 倒弃上清后，加入适量（20mL左右）的预冷的0.1M CaCl2，悬浮菌体，冰上放置30 min。
2） 4000 rpm离心5-10min，倒弃上清后再加入适量（20mL左右）的预冷的0.1M CaCl2，悬浮菌体。
3） 4000 rpm离心5-10 min，加入少量0.1M CaCl2+10%甘油悬浮菌体。
4、感受态保存
将上述感受态细胞分装于0.5 mL Eppendorf管（100mL/管）中，置于-70℃贮存备用。
5、感受态融化
从冰箱中取出制备好的感受态细胞，放在冰上，使其融化。并将准备好的质粒也放在冰上。
6、转化
在一个预冷的0.5mL Eppendorf管中加入100 μL感受态细胞和1μL质粒，混匀，置于冰上30min。42℃，90S后立即移至冰上。
7、 转化物液体培养
将转化后的混合物转至含有1mL SOC培养基的离心管中，37℃、200 rpm培养1h。
8、涂板与培养
取100 μL培养液，均匀涂布于LB 平板上。
LB 平板置于37℃培养箱过夜培养。培养好的平板放入4℃冰箱。
二、 电击感受态细胞的制备及转化
1、细菌培养
1）从平板上挑取大肠杆菌（DH5α或DH10B）单菌落，放到LB培养基中。（液体培养基的体积为溶液容积的1/3-1/4为宜）。
2）37℃，220 rpm培养10 h左右。
3）从中吸取2 mL培养液到装有200 mL LB培养基的三角瓶中，37℃，220 rpm培养2-3 h，使其OD600达0.8-1.0。
2、细菌收集
将培养液倒入预冷的50mL离心管中，置于冰上。3000 rpm离心5-10min。
3、甘油处理细胞
弃上清（倒干净）后，加入适量（20 mL左右）的预冷的10%甘油，悬浮菌体。
4、细胞保存
3000rpm离心5-10 min，倒弃上清后再加入少量10%甘油悬浮菌体。将上述菌液分装于0.5 mL Eppendorf管中，置于-70℃贮存备用。
5、感受态融化
从冰箱中取出制备好的感受态细胞，放在冰上，使其融化。并将准备好的质粒也放在冰上。
6、转化
在一个预冷的0.5mL Eppendorf管中加入100 μL感受态细胞和1μL质粒，混匀，置于冰上。连接好电击仪，电击杯预冷。将待击混合液加到电击杯两电极之间（不能有气泡），380V电击。
7、转化物液体培养
将转化后的混合物转至含有1mL SOC培养基的离心管中，37℃、200rpm培养1h。
8、 涂板与培养
取5 μL培养液，均匀涂布于LB 平板上。
LB 平板置于37℃培养箱过夜培养。培养好的平板放入4℃冰箱。
实验结果
在含Amp的LB平板上将看到若干白色的菌落，即是阳性克隆。
如果未出现阳性克隆，则可能是感受态细胞活性太低，或转化的效率太低。
注意事项
1、在所有的实验中要注意严格无菌操作。
2、所用耗材灭菌后使用。
3、感受态细胞不能放在常温下放置；必须在超低温下保存。
4、转化过程要严格控制时间和温度
相关知识
转化（transformation)：使受体细胞从周围介质中吸收外来DNA分子，从而获得新的遗传物质的过程就是转化。
感受态细胞（competent cell)：用于转化的细菌称为感受态细胞，它是指细菌细胞处于一种最易吸收外来DNA的状态。
载体（vector)：用于携带重组DNA，并能够使外源DNA能复制与表达的运载工具。
世界上现在使用较多的质粒载体主要有pBR322系列、pUC系列（如pUC18、pUC19、pUC118、pUC119）、M13系列、pSP系列、pGEM系列等。
pGEM-T
easy载体是将pGEM-Zf（+）用EcoRV在其两端加上“T”，这有利于PCR产物的克隆，因为PCR反应结束时，Taq酶会在PCR产物的末端加上一个“A”。pGEM-T
easy载体全长3015bp，含有多个限制性内切酶位点。限制性内切酶位点的两侧有T7、SP6
RNA聚合酶启动子位点，并且含有M13正、反向序列（如图）。pGEM-T easy载体作为一种商品化的载体存在几个优点：
（1） 与PCR产物连接效率较高。
（2） T7、SP6、M13位点有利于插入片段序列的测定。
（3） M13序列有利于插入序列的PCR扩增。
（4） 其两端都存在EcoRI酶切位点，使得插入序列酶切极为方便。
（5）含有LacZ基因，含重组质粒的菌落用蓝白斑鉴定。
