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胶原纤维的胶原蛋白的染色

2021.9.29

胶原纤维在HE染色法被染成粉红色，除此之外，它还可以用一些阴离子的染料来进行染色，如用淡绿可把它们染为绿色，用甲苯胺蓝可将其染为蓝色，在网状纤维染色中，如不加以处理，它又可被染为棕黄色。常用的特殊染色法有Van Gieson.Masson和Mallary等方法。在免疫细胞化学染色中，胶原纤维由于含的负电荷过多，常导致某些非特异性的染色，应特别注意。
（一）.Van Gieson（V.G）染色法
I. 试剂的配制：
weigert氏苏木素
A液：苏木素 1g （haematoxylin）
无水酒精 100ml
B液： 30%三氯化铁 4ml （ferric chloride）
蒸馏水 95ml
盐酸 1ml
II．Van Gieson氏液
A液：酸性品红 1g（acid fuchsin）
蒸馏水　 100ml
B液：苦味酸饱和水溶液，（1.22%）（picric acid）
注意事项：
1、Weigert氏苏木素临用前取A液和B液等份混合，几个小时内用完，最长不得超过一天。
2、苏木素配后经二十多天才能成熟，必须提前配制。
3、该液能抵抗弱酸性染液，对已着染的细胞核在酸性染液的作用，不易被脱去颜色，如果不特别深染，则无须分化。
4、Van Gieson氏液取B液9ml，加入A液1ml，即可使用。
操作方法：（后面的各种方法，如没特别说明，都在室温下进行）
1、切片脱蜡至水，
2、用Weigert氏苏木素染20min，
3、水洗，必要时可分化，
4、流水冲洗10min，
5、染Van Gieson氏液1min，
6、用95%酒精快速分化，
7、无水酒精脱水，二甲苯透明，封固。
结果：
胶原纤维：鲜红色，肌纤维：黄色，红细胞：黄色，细胞核：蓝黑或灰色。
注意事项：
1、该法染完的切片，较易褪色如需照相，应尽早完成。
2、苏木素染液如为棕色或沉淀，应将其抛弃。
3、分化用的酒精，应使用95%以上的酒精，低浓度的酒精褪色能力强，容易将着染的红色脱去。
4、切片也可以用天青兰苏木素替代Weigert氏苏木素，染核效果基本一样。
（二）.Masson氏三色染色法：天青石蓝液的配制：天青石蓝（Celestin blue B） 1.25g　硫酸铁铵（ferric ammonium sulfate）1.25g
蒸馏水 200ml
甘油（glycerin） 30ml
将前两者溶于蒸馏水中，然后煮沸，冷却后过滤，再加入甘油和麝香草酚。
Mayer氏苏木素的配制苏木素 0.1g　蒸馏水 100ml
钾明矾（Potassium alum） 5g
柠檬酸（Citric acid） 0.1g
水合氯醛（Chloral hydrate）20mg
配制法：
将苏木素放入蒸馏水中，用玻棒不停地搅拌直至完全溶解，再依次加入钾明矾，柠檬酸和水合氯醛，再继续搅拌，最后加入碘酸钠，搅拌均匀，即可使用。
丽春红酸性品红液的配制：　丽春红（ponceau 2R） 0.7g
酸性品红（acid fuchsin）0.3g
冰醋酸 1ml
蒸馏水 99ml
操作方法：　1
、切片脱蜡至水，　2、1%高锰酸钾氧化切片5min，
3、水洗，草酸漂白1min，
4、水洗，蒸馏水洗，天青石蓝染5min水洗，
5、摔去余液不用水洗，滴染Mayer氏苏木素3-5min，
6、流水冲洗5-10min，
7、丽春红苦味酸饱和液染5min，
8、1%醋酸水溶液洗，
9、1%磷钼酸分化切片约5min，
10、蒸馏水洗，
11、1%淡绿或者甲苯胺蓝滴染30s，
12、1%醋酸水溶液洗切片，
13、95%酒精分化，无水酒精脱水，
14、二甲苯透明，中性树胶封固。
结果：　胶原纤维呈现绿色或蓝色，细胞核呈现灰黑或灰蓝色，肌肉和胞质红细胞呈现红色。
注意事项：①Masson氏染液配完后保存时间不宜过长，如有可能，每次染色以染配为佳，如何可使着色颜色的鲜艳性。②切片在各级酒精中脱水，时间不宜过长，否则会将着染的颜色脱去。③切片保存所着染的颜色显长为1—2年以后会随着时间的延长而逐渐褪去，应予注意。④磷钼酸和磷钨酸在染色法中的作用各有不同，磷钼酸作用于胶原纤维，磷钨酸作用于纤维胶]质，肌胶质，神经胶质和上皮纤维等。上述两种试剂的使用，可以促进组织有选择的染色，它们可以减少背景和核的染色，使背景清晰。⑤　如有可能，在组织固定时，用Zenker氏固定液固定，如此对染色效果将更好。
临床应用：　1
、与淀粉样物的区别：胶原纤维发生病变如坏死或透明变性时，它与淀粉样物在HE染色时被染为粉红色，不好区别。应用V.G染色法，能将胶原纤维染为粉红色，而淀粉样物将被染为黄色。　2、应用与间胚叶来源肿瘤的区别：
如纤维瘤（肉瘤），平滑肌、横纹肌瘤（肉瘤），神经纤维瘤（肉瘤）、恶性纤维组织细胞瘤等，由于都含有大量的纤维，HE染色均为红色。应用Masson氏染色法，可将胶原纤维染色蓝色或绿色，肌源性组织被染为红色。
3、应用与其他慢性炎症的区别。
如慢性阑尾炎，疤痕愈合时，纤维愈复病灶可被染为鲜红色或蓝绿色，SARS病患者愈合后有的肺部可出现疤痕，粘连，此时可显示蓝色或绿色。
可用于鉴定肝硬化及创伤组织的修复程度。肝硬化时的肝组织有许多不同大小的假小叶，用上述方法显示时，可显示出不同的组织结构。V.G法可将包绕假小叶的胶原纤维染成红色，胆汗呈绿色。
小结
胶原纤维在上述的两种方法中着染不同的颜色，如V.G着染红色，Masson氏着染蓝色或绿色。这主要取决于染料对组织的渗透、吸附、沉淀和反应，而染料分子量的大小是关键，分子量小的分子移动迅速，行动快，对组织的渗透性较强，能穿透较为致密的组织。分子量大的染料分子移动较迟缓，渗透力较弱，可作用于组织强求构较疏松的组织，染色时间可适当延长。
在相关的染料中，分子量从小到大依次排列是：苦味酸（黄色）：229.11；桔黄G（黄色）：452；丽春红（红色）：480.42；酸性品红（红色）：585.53；苯胺蓝（蓝色）：737.72；亮绿（绿色）：792.72；甲基蓝（蓝色）>99。
染色是一个较为复杂的化学反应和物理作用的双重过程，在应用这些方法时，根据不同情况，选择不同的方法，认真地操作，方能获得最佳的效果。