RACE技术扩增构建全长cDNA文库
实验概要
利用RACE(利用PCR技术快速扩增全长mRNA)技术构建全长cDNA文库是传统C库构建技术的改进。本实验即是利用寡核苷酸帽法，进行全长C库的构建，从而掌握RACE技术的原理与基本操作方法。
实验原理
其原理是利用真核mRNA的3’poly(A)和5’帽子结构作为标签，用通用引物识别并配对标签序列，PCR扩增后克隆PCR产物，从而构建出全长并有正确阅读框架的C库。
RACE技术最早是cDNA水平上加接头，以扩增未知5’序列。而随着技术的进展，目前RACE技术已发展到直接以mRNA为模板进行操作，这就保证了全长cDNA的克隆，为研究5’和3’非编码区及启动子提供了条件。
RACE分3’RACE和5’RACE。3’RACE原理如图1。其用带olig(dt)和特异酶切位点的序列为3’引物；用特异序列为5’引物，经RT－PCR后，扩增出3’全长序列，利用特异酶切位点，插入载体。
5’RACE分两种，其一为SMART（Mechanism At 5' end of the RNA Transcript）技术，其原理为在合成cDNA的反应中事先加入的3'末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）或特异3’序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后扩增。由于有5'帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA其5’端为完整序列。其二为寡核苷酸帽法(Oligo capping method)。其原理如图2。具体为利用CIAP脱磷，而全长mRNA由于有帽子结构，不被CIAP作用，这样非mRNA及无帽子结构的5’不完整mRNA5’端为OH结构。然后用TAP（烟草酸性焦磷酸化酶，tobacco acid pyrophosphatase）焦磷酸化帽子结构，使5’完整的mRNA在5’端带磷酸基团。用RNA连接酶将无磷酸化的adapt连接到5’末端，3’引物RT后，adapt配对序列扩增，这时由于只有5’完整mRNA才有接头序列，因此扩增的结果只能是扩增出5’完整的mRNA。在此过程中PCR的放大作用，使低丰度的基因也能被信号放大。利用RACE技术构建全长cDNA文库，是综合利用3’和5’RACE，3’RACE引物选择poly(A)，5’RACE引物选择帽子结构，这样使得扩增产物为带有5’、3’非编码区、起始密码、中止密码的完整cDNA。利用RACE技术建库时，模板RNA可为总RNA或mRNA，但要扩增低丰度样品，以纯化的mRNA为模板为好。模板用量一般为总RNA1-5ug;mRNA为50-250ng。
主要试剂
RACE试剂盒（invitrogen），饱和酚、氯仿/异丙醇、EDTA、乙醇、3M NaAC pH 5.2、TE缓冲液
主要设备
恒温水浴，离心机、电泳仪、电泳槽、紫外观测仪
实验步骤
1. RNA、mRNA提取(略)
2. mRNA5’端加接头
1) 脱磷酸化
A. 按次序加入下述试剂
RNA/mRNA Xul(RNA1-5ug，mRNA50-250ng)
10×CIP buffer 1ul
RNase inhibit(40u/ul) 1ul
CIP(10u/ul) 1ul
加DEPC水到10ul
B. 混匀后50℃1hr， 轻微离心，置于冰浴。
C. 沉淀mRNA
a. 上述反应管中加入90ulDEPCH2O，用酚/氯仿抽提
b. 1/10体积，3MpH5.2乙酸钠、2体积乙醇沉淀，70％乙醇洗沉淀
c. 干燥后溶于7ulDEPC水中
2) 脱帽子结构
A. 依次加入下述试剂
脱磷酸化mRNA 7ul
10×TAP buffer 1ul
RNase inhibit(40u/ul) 1ul
TAP(0.5U/ul) 1ul
B.混匀后37℃1hr， 轻微离心，置于冰浴。
C. 沉淀mRNA
a. 上述反应管中加入90ulDEPCH2O，用酚/氯仿抽提
b. 1/10体积，3MpH5.2乙酸钠、2体积乙醇沉淀，70％乙醇洗沉淀
c. 干燥后溶于7ulDEPC水中
3) 加接头
A. 将上述7ul脱帽mRNA转移至一含0.25ug5’RACE引物的管中，充分混匀并溶解引物后，离心。
B. 65℃，5min，以释放可能有的二级结构，干燥至6ul，冰浴2min
C. 在上述6ul中依次加入
10×RNALigase buffer 1ul
RNase inhibit(40u/ul) 1ul
ATP(10mM) 1ul
T4RNALigase(5U/ul) 1ul
D. 混匀后37℃1hr， 轻微离心，置于冰浴。
E. 沉淀mRNA
a. 上述反应管中加入90ulDEPCH2O，用酚/氯仿抽提
b. 1/10体积，3MpH5.2乙酸钠、2体积乙醇沉淀，70％乙醇洗沉淀
c. 干燥后溶于10ulDEPC水中
4) 合成第一链
A. 10ul上述mRNA样品中加入1ul3’RACE引物，1uldNTP(10mM)，65℃，5min，以释放可能有的二级结构。
B. 冰浴2min，以退火（如用随机引物作3’引物，则在25℃放置10min。
C. 在上述6ul中依次加入
5×first buffer 4ul
RNase inhibit(40u/ul) 1ul
DTT(100mM) 2ul
SuperScriptII(反转酶)(200U/ul) 1ul
D.混匀后42℃50min。
E. 70℃15min 灭活RT酶，冰浴2min
F. 加入1ulRNA酶H（2U）37℃20min，水解Mrna（可不做）
5) PCR扩增
A. 反应液组成 5’与3’RACE引物各3ul，RT液2ul，其余同PCR实验
B. 反应参数 如下表
温度 | 时间 | 循环数 |
94℃ | 2min | 1 |
94℃ | 30sec | 5 |
72℃ | 1min/1kbDNA | |
94℃ | 30sec | 5 |
70℃ | 1min/1kbDNA | |
94℃ | 30sec | 20-25 |
60-68℃ | 30sec | |
68-72℃ | 1min/1kbDNA | |
68-72℃ | 10min | 1 |
6) PCR产物纯化(略)
7) PCR产物克隆 PCR产物克隆至PCR－TOPO载体中，具体操作(略)。
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