RLM-RACE法合成双链cDNA
实验概要
掌握合成双链cDNA的RLM-RACE技术，可构建高质量的cDNA文库。
主要试剂
1. 酶类及分子量标准
1) 高保真酶Easy-A high fidelity cloning enzyme,Merck公司Stratagene系列；
2) Taq DNA Polymerase，上海申能博彩生物技术有限公司；
3) DL 2000 DNA Marker，宝生物工程（大连）有限公司。
2. 主要试剂（盒）
1) GeneRacerTM Kit，美国Invitrogen公司；
2) SuperScriptTM II Reverse Transcriptate，美国Invitrogen公司；
3) dNTP，上海申能博彩生物技术有限公司；
4) 其他试剂为国产分析纯。
主要设备
1. MDF-192型超低温冰箱，日本三洋电机株式会社；
2. CF43S超净工作台，Gelman公司；
3. 高速冷冻台式离心机，Heraeus Sepatech公司；
4. Capsule HF-120型微量离心装置，Millipore公司；
5. BL150S型电子天平，德国Sartorius公司；
6. GB 1302型天平，Mettler-Toledo仪器（上海）有限公司
7. YXQ.WY21-600IIR卧式高压蒸汽消毒器，广州市医疗设备厂；
8. DYCD-31D型水平电泳槽，北京六一仪器厂；
9. EPS1001型电泳电源，Amersham Pharmacia公司；
10. 连续可调微量移液器，德国Eppendorf公司；
11. Primus 25型PCR基因扩增仪，德国MWG公司；
12. AlphaImager 2200型凝胶图像分析系统，Alpha Innotech公司；
13. XK96-B微型旋涡混合仪，江苏省姜堰市新康仪器厂。
实验材料
无菌感染期线虫RNA
实验步骤
1. 总RNA双链cDNA的合成
按照GeneRacerTM Kit 说明书的方法RLM-RACE法合成双链cDNA 。
2. RNA脱磷酸
1) 脱磷酸反应
A. 在无菌的1.5 mL离心管中依次加入下列组分建立反应体系（冰上操作）：
Total RNA | 3.6 µL | ||
10×CIP Buffer | 1 µL | ||
RNaseOutTM (40U/µL) | 1 µL | ||
CIP (10U/µL) | 1 µL | ||
DEPC water | 3.4 µL | ||
Total Volume | 10 µL |
B. 轻混反应物，微漩涡，微离，50℃温育1 h，微离后置于冰上。
2) 沉淀RNA
A. 在上述反应液中加入90 μL DEPC H2O和100 μL酚/氯仿，漩涡混匀 30秒；
B. 室温18000 rpm高速离心5 min；
C. 小心吸取上层水相到一新的离心管内；
D. 加入2 μL（10 mg/mL）mussel glycogen ，10 μL 乙酸钠（3 M，pH 5.2），温和混匀，再加入220 μL 95％乙醇，微漩涡混匀；
E. 置于-80℃，10 min；或-20℃过夜；
F. 4℃条件下，18000 rpm离心20 min，获得沉淀的RNA；
G. 小心吸弃上清液，加入500 μL 70％乙醇，上下颠倒混匀，再微漩涡；
H. 4℃，18000 rpm离心2 min，吸弃上清，再离心几秒，用移液器彻底除去乙醇，风干；
I. 沉淀溶于8 μL DEPC H2O中，取1 μL进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。
3. mRNA脱帽
1) 脱帽反应
A. 在无菌的1.5 mL离心管中依次加入下列组分建立反应体系（冰上操作）：
脱磷酸RNA | 7 µL | ||
10× TAP Buffer | 1 µL | ||
RNaseOutTM (40U/µL) | 1 µL | ||
TAP (40U/µL) | 1 µL | ||
Total volume | 10 µL |
B. 轻混反应物，微漩涡，微离，37℃温育1 h，微离后置于冰上。
2) 沉淀RNA
方法同1中2）
4. 脱帽mRNA与RNA Oligo的连接
1) 连接反应
A. 加7 μL脱磷酸、脱帽的RNA至GeneRacerTM RNA Oligo中，用吸头混匀，微离收集液体；
B. 65℃温育5 min，冰上致冷，微离；
C. 在管中依次加入下述组分建立反应体系：
10× Ligase Buffer | 1 µL | ||
10 mM ATP | 1 µL | ||
RNaseOutTM (40U/μL) | 1 µL | ||
T4 RNA Ligase (5U/μL) | 1 µL | ||
Total volume | 10 µL |
D. 37℃温育1 h，微离，冰上致冷。
2) 沉淀RNA
方法同1中2），最后加11 μL DEPC H2O，取1 μL进行电泳检测。
5. 反转录第一链cDNA
1) 依次加入下述组分于上述10 μL连接体系中：
GeneRace Oligo dT Primer | 1 µL | ||
dNTP Mix | 1 µL | ||
RNaseOutTM (40U/μL) | 1 µL |
2) 65℃温育5 min，冰上致冷2 min，微离；
3) 依次加入下述组分于上述13 μL混合体系中：
5× First Strand Buffer | 4 µL | ||
0.1 M DTT | 1 µL | ||
RNaseOutTM (40U/μL) | 1 µL | ||
SuperScriptTM III RT (200U/μL) | 1 µL | ||
Total volume | 20 µL |
4) 吸头混匀，微离，50℃温育1 h；
5) 70℃，15 min终止反应，冰上冷却2 min，微离心（室温，18000 rpm）；
6) 混合反应物中加入1 μL的RNase H（2 U）, 37℃温育20 min；
7) 微离，直接用于PCR扩增或-20℃贮存。
6. PCR扩增dscDNA
以反转录第一链cDNA为模板，按以下组分，建立PCR反应体系：
ddH2O | 36.5 µL | |
10×PCR buffer | 5 µL | |
dNTP Mix (10 mmol/L) | 1 µL | |
GeneRacerTM 3’ Primer (10 µmol/L) | 3 µL | |
GeneRacerTM 5’ Primer (10 µmol/L) | 3 µL | |
RT template | 1 µL | |
Easy-A high fidelity cloning enzyme | 0.5 µL | |
Total volume | 50 µL |
充分混匀，按以下程序进行PCR扩增：95℃热变性2 min，迅速加入高保真酶，再94℃变性2 min进入循环，94℃变性30 秒，65℃退火30秒，68℃延伸2 min，25个循环后于68℃继续延伸10 min。扩增产物以琼脂糖凝胶电泳检测，置于-20℃保存备用。
