新生物学活性测定方法介绍
近年来，抗体药物的接连上市和重磅销售引发国内外抗体类生物治疗药物的研发热潮。活性测定是对药物的有效成分和含量以及药物效价的测定，是确保抗体类药物有效性的重要质控指标。现阶段抗体药物的活性分析方法主要是体外( in vitro) 检测，主要有基于细胞、转基因细胞以及新技术应用三方面对抗体药物活性测定的方法，为抗体药物的研发和质量控制提供新思路[1]。
小编今天主要分享基于新技术的生物学活性测定方法，此方法可应用于抗体类药物的活性评价，包括表面等离子共振效价测定法、均相时间分辨荧光、 Alpha技术、荧光染料标记法等。
表面等离子共振效价测定法
表面等离子共振技术（SurfacePlasmonResonance，SPR）是一种用于生物分子间相互作用分析的新技术，在抗体药物的研发、生产以及质量控制方面取得了良好的应用。近年来该技术在生物医药领域比较新颖，在技术方面不断更新，在灵敏度、特异性以及实用性取得了较大的进步。此外在抗体制药行业中占据着巨大的优势。
表面等离子共振现象是发生在两种折射率不同的介质界面上的一种光学现象。当光源的一束入射光从高折射率介质(如玻璃)射向低折射率介质(如溶液)的界面时，如果入射角大于一定的临界角，入射光将会被100%地反射至光源的同一侧，这叫做全反射现象。当两种介质之间有一层极薄的金属膜(最为常见的50nm金膜)，这时入射光的能量将会引起金膜中等离子体的共振并以一种电磁场(称作消逝波)的方式弥散至低折射率介质一侧(如溶液)，从而导致反射光的能量在某个特定的角度降至最低，这一角度被称作SPR角[1]，因此可以通过对生物反应过程中SPR角的动态变化获取生物分子之间相互作用的特异信号。该技术的样品消耗量较低，一般仅有微克级；也无需预先标记荧光、二抗的分子；同时使用亲和力信息及动力学信息来阐述分子间结合机理。
图1 SPR技术作用原理[2]
均相时间分辨荧光
均相时间分辨荧光（homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF）是用来检测纯液相体系中待测物的一种常用方法，也是用来研究药物靶标的理想平台。该技术结合了荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF，Time Resolved Fluorescence)）两种技术。HTRF技术是利用了供体（如Eu穴状化合物，长寿命荧光）和受体（如XL665，短寿命荧光）之间接近时产生的荧光共振能量转移。因为Eu的荧光衰减周期较长，所以含Eu的供体会诱导XL665受体长时间地发射荧光，受体激发后产生的荧光便能持续较长时间，通过时间分辨就可以区分那些短寿命的自身散射的荧光，这样从短寿命荧光背景中就很容易区分出FRET信号[3]，此信号与结合产物形成成正比，采用双波长激发光可以检测生物分子相互作用下的荧光信号变化，减少缓冲液和介质的干扰。
HTRF技术进入药物研发领域以来，加快了很多基于抗体的研究，因为HTRF具有同等的检测范围和检测极限，不需要洗涤步骤，实验方式操作简单，而且减少了实验时间和花费。所以该技术近年来已被应用于抗体的活性检测。
图2 HTRF技术原理[4]
Alpha技术
近年来，Alpha技术（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay）也应用于抗体的活性检测，该技术需要两个由不同的化学混合物组成的微珠，分别为供体微珠(Donorbeads)和受体微珠(Acceptorbeads)。两种微珠分别行使不同的功能，其中供体微珠包含了光敏剂苯二甲蓝(Phthalocyanine)，在680nm激光的照射下，它周围环境中的氧分子转化成一种高能活跃的氧状态-单体氧(Singlet Oxygen)。供体微珠能够产生大约60,000个左右的单体氧小分子，10在4μs的半衰期内，单体氧可以在溶液中扩散高达200nm的距离。如果在该范围内存在受体微珠，单体氧就会触发受体微珠的二甲基噻吩衍生物，继而通过激发一系列的化学反应，最终在520-620nm产生光信号，从而达到检测目的[5]。
图3 Alpha技术作用原理[6]
随着各类新型生物标志物以及药物靶点的发现，尤其是近年来抗体等生物大分子的迅猛发展，Alpha技术依靠其自身的优势和特点，能够应用到各个研究领域，包括血管生成、癌症、心血管、炎症、等多种疾病领域。特别是在药物研发领域，由于其供稳定的、高灵敏的、可自动化的、可重复且低成本的特点，它将会受到越来越多的科研工作者的青睐。
荧光染料标记法
在近几年飞速发展的研究进展中，荧光染料标记法已被广泛应用于蛋白质标记、DNA检测、医药卫生和环境检测等领域。近年来BODIPY(氟化硼二吡咯)类荧光染料作为一类新型的荧光染料，由于其优良的性质和广阔的应用前景在过去的二十年内得到广泛的研究。与其它的荧光染料相比，BODIPY类荧光染料的光谱峰宽比较窄、检测灵敏度较高、较高的摩尔吸光系数、光稳定性能非常优越以及较高的荧光量子产率等。
例如，抗PCSK9单抗的的生物活性测定即是用BODIPY标记的低密度脂蛋白(LDL)通过HepG2细胞来测定其生物活性。Evolocumab是一款靶向PCSK9的单克隆抗体。当它与PCSK9结合后，能抑制PCSK9结合低密度脂蛋白受体（LDL-R）。在没有药物存在的情况下，这些LDL-R通过与PCSK9的结合，会被降解。而在evolocumab的作用下，LDL-R能逃脱被降解的厄运，回到肝细胞表面，清除血液里的低密度脂蛋白，从而降低血液中的低密度脂蛋白胆固醇水平[7]。抗PCSK9抗体能够与PCSK9结合，阻滞PCSK9与LDLR结合，增加LDLR数目，从而增加HepG2细胞中BODIPY标记的LDL荧光量。
图4 PCSK9抑制剂的作用机制[8]
参考资料
[1] 王兰，徐冈，等. 抗体类生物治疗药物活性测定方法. 中国生物工程杂志，2015，35（6）：101—108
[2] 朱磊，高凯，等．单克隆抗体生物治疗药物研究进展．中国药学杂志，2014，49（23）：2058-2064．
[3] http://meeting.dxy.cn/Cisbio2011/article/i15729.html
[4] François Degorce, Amy Card, et al. HTRF: A Technology Tailored for Drug Discovery–A Review of Theoretical Aspects and Recent Applications. Current Chemical Genomics, 2009, 3, 22-32
[5] https://med.sina.com/article_detail_103_2_11911.html
[6] https://data.pharmacodia.com
[7] http://m.sohu.com/a/160671003_282570?_f=m-article_24_feeds_3
[8] PharmDr.Anna Oleárová, PhD., MPH,et al. Novel targeted therapeutics in dyslipoproteinemia, Prakt. lekarn., 2015; 5(3-4): 92–96
