免疫荧光细胞化学染色方法
免疫荧光细胞化学染色方法 一、标本制作 可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片，经适当固定或不固定，作免疫荧光染色用。 二、荧光抗体染色方法 （一）直接法 1．染色 切片经固定后，滴加经稀释至染色效价如1：8或1：16的荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光 抗体或兔抗人 IgG 或 IgA 荧光抗体等），在室温或37℃染色30min，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止 干燥。 2．洗片 倾去存留的荧光抗体，将切片浸入 pH7.4或 pH7.2PBS 中洗两次，搅拌，每次5min，再用蒸 馏水洗1min，除去盐结晶。 3．用50%缓冲（0.5mol/L 碳酸盐缓冲液 pH9.0～9.5）甘油封固、镜检 4．对照染色 ①正常免荧光血清染色，如上法处理切片，结果应为阴性。②染色抑制试验（一步法）：将荧光抗体和 未标记的抗体球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法处理切片。结果应为阴性。为证明此种染色抑制不 是由于荧光抗体被稀释所致，可用盐水代替未标记抗血清，染色结果应为阳性。此法结果较二步法稳定。 ③类属抗原染色试验，前面已作叙述。 直接法比较简单，适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研 究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原，特异性高而敏感性较低。 （二）间接法 （1）切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度， 37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS 洗两次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液体。 （2）再滴加间接荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等），同上步骤，染色30min，37℃，缓冲盐 水洗两次10min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。 对照染色：①抗体对照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性。 ②抗原对照：即类属抗原染色，亦应为阴性。③阳性对照。 间接法中上述方法称双层法（Double Layer Method）。另一种称夹心法，即用未标记的特异性抗原加 在切片上先与组织中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞 中抗体的存在，方法步骤如下： ①切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。 ②滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃，30min。 ③缓冲盐水洗2次，每次5min，吹干。 ④滴加特异性荧光抗体再用切片于37℃，30min。 ⑤如③水洗。 ⑥缓冲甘油封固，镜检。 间接法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原，敏感性较高，操作方法较易掌握，而且能解决一些 不易制备动物免疫血清的病原体（如麻疹）等的研究和检查，所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血 清的试验。 （三）补体法 1．材料 （1）免疫血清60℃灭活20min，用 Kolmers 盐水作2倍稀释成1：2，1：4，1：8……。补体用1：10 稀释的新鲜豚鼠血清，抗补体荧光抗体等，按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价，如为1：32 则免疫血清应作1：8稀释。 （2）补体用新鲜豚鼠血清一般作1：10稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果，按2单位的比例， 用 Kolmers 盐水稀释备用。Kolmers 盐水配法：即在 pH7.4、0.1mol/L 的磷酸缓冲盐水中，溶解 MgSO4的 含量为0.01%浓度。 （3）抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为1：4，补体为2单位的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠 球蛋白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价1：4的浓度用 Kolmers 盐水稀释备用。 2．方法步骤 （1）涂片或切片固定。 （2）吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液（此时免疫血清及补体又都稀释一倍）滴于切片 上，37℃作用30min，置于保持一定湿度的染色盒内。 （3）用缓冲盐水洗2次，搅拌，每次5min，吸干标本周围水液。 （4）滴加经过适当稀释之抗补体荧光抗体30min，37℃，水洗同（3）。 （5）蒸馏水洗1min，缓冲甘油封固。 3．对照染色 （1）抗原对照。 （2）抗血清对照：用正常兔血清代替免疫血清。 （3）灭活补体对照：将补体经56℃30min 处理后，按补体同样比例稀释，与免疫血清等量混合后，进 行补体法染色。 本法之荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制，因而一种荧光抗体可作更广泛的应用，敏感性亦较 间接法高，效价低的免疫血清亦可应用，节 省免疫血清，尤其是对检查形态小的如立克氏体、病毒颗粒 等或浓度较低的抗原物质时甚为理想。 （四）膜抗原荧光抗体染色法 本法应用直接法或间接法的原理和步骤，可对活细胞在试管内进行染色，常用于 T 和 B 细胞、细胞培 养物、瘤细胞抗原和受体等的检查和研究，阳性荧光主要在细胞膜上。FACS 即采用此法原理。 （五）双重染色法 在同一标本上有两个抗原需要同时显示（如 A 抗原和 B 抗原），A 抗原的抗体用 FITC 标记，B 抗原的 抗体用罗达明标记，可采用以下染色方法： 1．一步法双染色 先将两种标记抗体按适当比例混合（A+B），按直接法进行染色。 2．二步法双染色 先用 RB200标记的 B 抗体染色，不必洗去，再用 FITC 标记的 A 抗体染色，按间接法 进行。 结果：A 抗原阳性荧光呈现绿色，B 抗原阳性呈现桔红色荧光。 （六）荧光抗体再染色法 若切片或其他标本经某种荧光抗体染色后，未获得阳性结果，而又疑有另外的病原体存在时，可用相 应的荧光抗体再染色。 有时存档蜡块不能再用以切片，也可用存档的 HE 染色标本，褪去盖片和颜色，再作免疫荧光或其它免疫细 胞化学的染色。 三、荧光抗原染色法 某些抗原可以用荧光素标记，制成荧光抗原，标记荧光素的方法与制备荧光抗体方法相同。用荧光抗 原可以直接检查细胞或组织内的相应抗体，特异性较好，敏感性较差。染色方法同荧光抗体染色的直接法。 由于多数抗原难以提纯或量少不昂贵，一般很少采用此法。
