如何做蛋白亚细胞定位实验？
生物功能的区域化是生命的一种基本现象，这种区域化是通过不同层次的系统组成，从器官到特异细胞，再到细胞内部的亚细胞结构，最后到大分子复合物。在细胞水平，蛋白在特定的时间和空间发挥作用，这种区域化的定位为蛋白发挥作用提供特定的化学环境以及所需的互作因子等。蛋白的错误定位容易导致细胞活动的紊乱。因此，了解蛋白的亚细胞定位对于研究基因的功能、蛋白互作及其作用机理是必要的。
Fig. 人体细胞内的亚细胞结构。Peter J. Thul et al.， Nature. 2017.编辑
研究蛋白亚细胞定位的方法有哪些？
1、计算机预测，可使用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）
2、荧光蛋白原位鉴定
3、免疫荧光标记
4、定量色谱，可以鉴定细胞内在梯度电泳中分布相似的或通过酶切处理标记的蛋白
小编推荐第二种方法，是近年来分子生物学实验最常用的方法之一，下面我们来看看方法二吧！
概念是什么？
采用瞬时转化技术，利用激光共聚焦显微镜（Confocal microscopy）观测某种蛋白在细胞内的具体位置，例如在细胞核内、细胞质内、细胞膜或细胞器上。
原理是什么？
将目标基因与荧光蛋白的N端或者C端融合，通过瞬时转化技术使该融合蛋白在受体材料细胞内表达，通过观察荧光蛋白在细胞内显示的位置确定目标蛋白的位置，从而确定目标蛋白的亚细胞定位情况。
适用于什么实验场景？
1. 基因功能研究，paper里总少不了这一项
2. 研究蛋白相互作用，与酵母双杂实验结果相互验证
同时2有个单独的名字——双分子荧光互补技术（Bimolecular fluorescence complementation，简称BiFC），将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接。若两个目标蛋白因为有相互作用而接近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光。
Fig. BiFC原理图编辑
实验方法
按实验材料的不同分为三类：
一、原生质体
构建载体→制作原生质体+转化质粒→激光共聚焦显微镜观察编辑
二、烟草叶片
构建载体-农杆菌转化-注射烟草叶片-激光共聚焦显微镜观察
三、动物细胞
构建载体-转化质粒-激光共聚焦显微镜观察
敲黑板 划重点：共定位实验，一定要选用文献已发表的做过亚细胞定位的蛋白作为对照哦！
常见的问题
原生质体转化效率低，需要注意水浴的温度，适宜的温度可以起到事半功倍的作用。
烟草瞬时转化常见的问题：
1. 转化效率低：需注意农杆菌的活性，建议侵染烟草叶片的农杆菌OD600值为0.6；
2. 生长4-5周的烟草苗比较适合注射。
原生质体瞬时转化的注意事项：
1. 原生质体非常脆弱敏感，操作需轻缓，环境培养温度要求严苛；
2. W5溶液是维持细胞渗透压最关键的溶液：浓度过高，细胞会瘪；浓度过低，细胞会破；
3. W5溶液的最适为pH5.7-5.8；
4. 苗龄过高或育苗时水分不足会产生较多的淀粉粒；
5. 细胞经过多次洗涤，在洗涤转移上清液时，枪头要从上部轻轻吸取，尽量减少细胞震荡，避免细胞损失。
亚细胞定位不亮的原因（相对于老师自己寄送材料而言）：
1. 质粒问题：质粒浓度不够；质粒已降解；空载体自身的转化效率不高；
2. 目的蛋白和荧光蛋白的相对位置；
3. 载体构建问题：所构建的载体中荧光蛋白是否移码；目标基因是否去除终止密码子（gene-GFP）；目标基因是否包含ATG启动子（GFP-gene）；
4. 物种差异；
5. 目标蛋白空间折叠的问题，如果目标蛋白较大会将荧光蛋白包裹起来，建议用Linker隔开；
6. 有些目的蛋白包含信号肽，若构建荧光蛋白-目的蛋白的形式，是会影响定位情况或直接导致没有荧光。
