二抗孵育时间
二抗孵育时间为1至2小时。
参考二抗的说明书，按照适当比例用封闭液稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗。吸尽洗涤液后，立即加入稀释好的二抗，室温在摇床上缓慢摇动孵育1至2小时。回收二抗。二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例。
一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景的深浅。要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；还要注意一抗二抗的匹配。收到抗体后按要求离心后再打开管盖进行分装和保存。
二抗孵育注意事项
抗体保存注意事项，收到抗体后按要求离心后再打开管盖进行分装和保存；对于大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在零下二十度；分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10ul每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。
复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在四十摄氏度，避免再冻起来；绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。大部分抗体收到后四十摄氏度短暂保存1至2周对抗体活性是没有影响的。长期保存，加入叠氮纳，防止细菌污染。
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