二抗孵育时间及注意事项
二抗孵育（Secondary antibody inucubation）
参考二抗的说明书，按照适当比例用封闭液稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗。
吸尽洗涤液后，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在摇床上缓慢摇动孵育1~2小时。回收二抗。然后加入Western洗涤液，在摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
前2步洗涤是为了洗去一抗和二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。洗涤液使用 TBST 或者 PBST,其中的 Tween20 有助于去除非特异性的结合，减少背景。同时短时间多次的洗膜（如 5-6次，每次 3分钟）比长时间少次数的洗膜更有效。
第3步TBS洗涤是为了洗去膜上的Tween-20,因为它可以阻碍底物的沉积。
注意事项
1） 抗体保存注意事项：
2）收到抗体后按要求离心后再打开管盖进行分装和保存！
3）对于大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在-20℃ .
4）分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10 ul每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。
5）复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在40℃，避免再冻起来！
6）绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。
7）大部分抗体收到后40℃短暂保存1-2周对抗体活性是没有影响的。
8）长期保存，加入叠氮纳，防止细菌污染。
一抗/二抗使用问题：
一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景的深浅。要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；还要注意一抗二抗的匹配。
天然和非还原样品问题：
有些抗体只能识别的表位是非连续氨基酸，这些氨基酸虽然在蛋白质一级结构中彼此不连续，但是在空间结构中则是靠在一起的。这些抗体就只能识别靶蛋白的空间结构状态（抗体说明书中会有特殊说明）。对于这些样品，缓冲液和凝胶中就不能含有SDS,并且不能够对蛋白进行加热变性。
有些抗体只能识别蛋白的非还原状态如氧化状态，对此类样品，就需要将缓冲液和凝胶中的还原剂DTT和beta-巯基乙醇去除。
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