流式细胞术DNA分析影响因素探讨
摘要 本文用流式细胞术对正常人外周血单个核细胞就不同试剂、不同获取细胞条件进行DNA含量分析。结果表明，正常人外周血单个核细胞的G0/G1、SPF、PI检出率所用染色试剂间均无明显差异(P＞0.05)，而APO、CV测定值随试剂不同有差异。获取5 000细胞/样品的CV值明显高于10 000细胞/样品(P＜0.05)；中、低速进样测得的CV值显著低于高速进样(P＜0.05)。据此认为，试剂质量及获取和分析的正确与否是影响DNA分析结果的重要因素，质控必不可少。
关键词 流式细胞术 脱氧核糖核酸
DNA倍体分析对肿瘤、血液病的诊断、治疗和预后判断等均有重要的参考价值［1，2］。用流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)分析具有简单、快速、计数细胞量大，重复性好，灵敏度高等优点，但也受多种因素影响。本文就细胞的获取、分析和应用不同试剂对外周血单个核细胞DNA含量分析结果的影响及可能出现的问题作简要探讨。
材料和方法
一、 检查对象 健康体检合格的成年人50名。
二、 仪器和主要试剂 FACS Calibur流式细胞仪系Becton-Dickinson(B-D)公司产品。甲试剂：碘化丙啶一步法综合染液，配制及使用参见文献［3］。乙试剂：三步法DNA染色试剂，配制及使用详见文献［4］。丙试剂为B-D公司配套DNA染色试剂，按说明书严格操作。
三、 测定方法
1.标本检测 取受检者肝素抗凝血，接常规分离单个核细胞，继用pH 7.4 PBS洗二遍，配成1×106/ml细胞悬液，分3份分别用甲、乙、丙试剂按各自的操作步骤进行染色后上机检测。用Cell Quest软件自动获取10 000细胞/样品，用Mod Fit LT软件程序分析细胞DNA含量。
2.分析指标 ①细胞凋亡(APO)：在DNA直方图上，二倍体G0/G1细胞峰前出现一个亚二倍体DNA含量的细胞峰为APO峰。
② G0/G1细胞比率：G0/G1(%)＝［G0/G1÷(G0/G1+S+G2M)］×100%。
③ S期细胞比率(SPF)：SPF(%)＝［S÷(G0/G1+S+G2M)］×100%。
④ 增殖指数(PI)：PI(%)＝［(S+G2M)÷(G0/G1+S+G2M)］×100%。
⑤ DNA指数(DNA index,DI)和DNA倍体分类。
⑥ G0/G1峰的变异系数(CV)值。(注：G0/G1期细胞为静止期和DNA合成前期细胞，均为二倍体DNA含量，S期为DNA合成期细胞，G2M期是DNA合成后期及分裂期细胞，均为四倍体DNA含量)。所得结果用均值t检验和配对t检验。
结果和讨论
一、 不同试剂的测定结果 表1显示G0/G1、SPF、PI检出率3组染色试剂间均无明显差异(P＞0.05)，而APO、CV测定值，甲试剂法明显高于乙、丙试剂(P＜0.001)；后两者无显著性差异(P＞0.05)。这可能是甲试剂无四氯精胺和胰酶，在染色中不能稳定未固定的细胞及消化细胞质碎片，受损破坏的细胞及细胞碎片经染色后显示在APO峰的位置，导致APO检出率偏大。本文发现甲试剂染色后细胞聚集体偏多，通过设“门”可将其去除，但实际所分析的细胞数不足10 000细胞/样品，影响了CV值。因此，应确保足够的完整细胞参与分析。
表1 3种染色法对细胞G0/G1、SPF、PI、APO 和CV值的影响(±s)
n G0/G1(%) SPF(%) PI(%) APO(%) CV(%)
甲试剂 50 99.30±1.13 0.45±0.17 0.70±0.29 0.27±0.11 3.08±0.32
乙试剂 50 99.35±1.08 0.43±0.15 0.65±0.19 0.16±0.08 2.52±0.49
丙试剂 50 99.37±0.67 0.40±0.14 0.63±0.21 0.15±0.07 2.49±0.36
二、 获取细胞数和进样速度 在FCM测定前应用质控微球调校其分辨率达到最佳的稳定状态。本文通过20份标本的配对观察，发现获取5 000细胞/样品与10 000细胞/样品的CV值分别为2.66±0.42和2.49±0.36有明显差异(P＜0.05)。此外中、低速进样测得的CV值显著低于高速进样(P＜0.05)。因此，在保证获取足够的样品细胞数外要控制进样速度。一般细胞数不小于10 000细胞/样品，进样速度控制在100～400细胞/秒。
三、 设“门”及分析技术 Mod Fit LT是专门用于流式细胞术中细胞周期分析的软件。它通过对DNA含量直方图进行曲线拟合，能快速计算出各种倍性细胞的含量，细胞周期各时相及亚二倍体细胞所占的比例，DI、G0/G1峰的CV等，使用相当方便。但用此软件分析先要在前向角光散射(Forward Scatter,FSC)对侧向角光散射(Side Scatter,SSC)及荧光2宽度(Fluorescence2-Width,FL2-W)对荧光2面积(Fluorescence2-Area,FL2-A)二维点图上设“门”，以排除细胞聚集体及细胞碎片的干扰。手动分析时，要选择合适的分析模式，并确认好各峰的峰位和宽度。分析结束后，要检查最后的拟合曲线与原始数据的曲线是否吻合。当G0/G1峰左边出现不明显的亚二倍体峰时，单就软件现有的功能很难分析APO含量，应考虑用Cell Quest软件来分析。
参 考文献
［1］ 张冬成，陈秉燮，梅品超，等．食管癌多部位DNA含量分析及其临床意义．癌症，1999；18(1)∶69
［2］ 周景应，黄昌亮，张盈华．流式细胞仪动态检测成人急性白血病细胞动力学的临床意义．实用肿瘤杂志，1996；11(4)∶152
［3］ 周振荣，张军妮，孙克华等.颅内肿瘤DNA含量的流式细胞术计量分析．中国癌症杂志，1994；4(2)∶170
［4］ 宋平根，李素文主编.流式细胞术的原理和应用.第一版.北京师范大学出版社，1992∶100
金秀国（浙江省舟山市人民医院 316004）
方国安（浙江省舟山市人民医院 316004）
刘波（浙江省舟山市人民医院 316004）
