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茚三酮显色反应的影响因素分析

2022.11.15

茚三酮与谷氨酸的显色反应灵敏度较高 ,但同时也受到多种因素的影响。

当实验条件控制不好时 ,会造成实验数据的较大偏离 ,从而产生较大的误差。此显色反应的影响因素主要有以下几方面。

谷氨酸浓度的影响

实验表明 ,谷氨酸与茚三酮水溶液在表 3所注条件下反应的最低显色浓度为70μg/ mL 。随谷氨酸浓度变大 ,显色逐渐变深。当浓度大于 140μg/ mL 时 ,所显颜色过深且其光密度值超出量程。当谷氨酸浓度在 80～140μg/ mL时 ,颜色变化明显且显色较稳定。

表1 浓度对显色反应的影响
谷氨酸浓度(μg/ mL)	颜色变化
60 70 100 150	基本无色略带浅蓝浅蓝深蓝

注 :90 ℃下水浴 25 min ,谷氨酸标准液 5mL ,茚三酮水溶液 1mL ,p H6. 0。

pH 值的影响

以 100μg/ mL 的谷氨酸标准液在不同pH下进行显色反应 ,测得结果如表。

表 2 pH 值对显色反应的影响
谷氨酸浓度(μg/ mL)	pH 值	颜色变化
100 100 100 100 100	2 4 6 8 10	无色无色浅蓝浅蓝浅蓝

注 :90 ℃下水浴 25 min ,谷氨酸标准液 5mL ,茚三酮水溶液 1mL

由表 2可见 ,显色反应随 pH的不同颜色有明显的变化。当 pH在 4 以下时不显色 ,而 pH 在 6～10 时 ,颜色变化明显。但因茚三酮的水溶液在碱性条件下溶液本身带有明显的淡黄色 ,因此 pH选定在 6 左右较好 ,此时基本无颜色干扰且显色稳定。

温度及反应时间的影响

实验表明 ,温度和反应时间对此显色反应的影响也很大。以 100μg/ mL 的谷氨酸标准液在 70 ℃进行显色发应时 ,发现即使加热30 min 也基本无颜色变化。当温度为 80 ℃时 ,加热 30 min 以上有颜色变化 ,而当温度为 90 ℃时 ,加热 15 min 左右即有明显的颜色变化 ,沸水加热时颜色变化也很明显。但考虑到蒸发的影响 ,所以实验选用 90 ℃作为最佳反应温度。在显色反应中 ,反应时间主要根据具体的颜色变化而定。一般来说 ,当谷氨酸浓度在 80～140μg/ mL 时 ,90 ℃加热 20 min 以上即可完全反应。时间太短 ,反应不完全 ,颜色梯度不明显 , 所以最佳反应时间在 20 ～25 min。

表 3 温度及反应时间对显色反应的影响
谷氨酸浓度 (μg/ mL )	pH	反应时间 (min)	反应温度( ℃)
70	80	90
100 100 100 100	6. 0 6. 0 6. 0 6. 0	15 20 25 30	无色无色无色无色	无色无色无色浅蓝	无色浅蓝浅蓝浅蓝

注 :谷氨酸标准液 5mL ,茚三酮水溶液 1mL 。

其它影响因素

茚三酮的不同溶剂对显色反应也有影响。实验表明 ,茚三酮的丙酮溶液在 80 ℃以上时显色较好 ,而茚三酮的水溶液要在 90 ℃以上时显色才明显。茚三酮的用量对显色反应的影响不大 ,可选择 5mL (或 3mL) 被测液与 1mL (或 0. 5 mL) 茚三酮溶液反应。测定时 ,最好选择谷氨酸标准样与待测稀释液一同水浴 ,这样可提高测定的准确度。此外 ,当被测样品中含有其它氨基酸时也可与茚三酮发生显色反应 ,从而影响测定结果。但在谷氨酸发酵中 ,所产的谷氨酸含量一般是其它氨基酸的几十倍 ,故此影响因素可忽略不计。

总之 ,茚三酮比色法作为一种谷氨酸的定量检测方法 ,具有操作简单、成本低的优点。只要控制好实验条件 ,就能取得较好的测量结果。这对于一般实验室的样品分析及味精生产厂家的谷氨酸产品测定 ,有较好的实用价值。

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