生化实验讲义(理论部分)——层析技术（七）
3.3 离子交换层析
3.3.1 简介
离子交换层析（Ion Exchange
Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。
3.3.2 基本原理
离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。离子交换反应可以表示为：
阳离子交换反应：( R?X? ) Y? + A? ? ( R?X? ) A? + Y?
阴离子交换反应：( R?X? ) Y? + A? ? ( R?X? ) A? + Y?
其中R代表离子交换剂的高分子聚合物基质，X? 和X? 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团，Y? 和Y? 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子，A? 和A? 分别代表溶液中的离子基团。
从上面的反应式中可以看出，如果A离子与离子交换剂的结合力强于Y离子，或者提高A离子的浓度，或者通过改变其它一些条件，可以使A离子将Y离子从离子交换剂上置换出来。也就是说，在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。
阴离子交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后，负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合，随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置换出来，随洗脱液流出。与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来，而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来，从而达到分离目的。
各种离子与离子交换剂上的电荷基团的结合是由静电力产生的，是一个可逆的过程。结合的强度与很多因素有关，包括离子交换剂的性质、离子本身的性质、离子强度、pH、温度、溶剂组成等等。离子交换层析就是利用各种离子本身与离子交换剂结合力的差异，并通过改变离子强度、pH等条件改变各种离子与离子交换剂的结合力而达到分离的目的。离子交换剂的电荷基团对不同的离子有不同的结合力。一般来讲，离子价数越高，结合力越大；价数相同时，原子序数越高，结合力越大。如阳离子交换剂对离子的结合力顺序为：Li? < Na? < K? < Rb? < Cs? ；Na? < Ca2? < Al3? < Ti4? 。蛋白质等生物大分子通常呈两性，它们与离子交换剂的结合与它们的性质及pH有较大关系。以用阳离子交换剂分离蛋白质为例，在一定的pH条件下，等电点pI < pH的蛋白带负电，不能与阳离子交换剂结合；等电点pI > pH的蛋白带正电，能与阳离子交换剂结合，一般pI越大的蛋白与离子交换剂结合力越强。但由于生物样品的复杂性以及其它因素影响，一般生物大分子与离子交换剂的结合情况较难估计，往往要通过实验进行摸索。
3.3.3 离子交换剂的种类和性质
离子交换剂的基质
离子交换剂的大分子聚合物基质可以由多种材料制成，聚苯乙烯离子交换剂（又称为聚苯乙烯树脂）是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔网状结构的聚苯乙烯为基质。聚苯乙烯离子交换剂机械强度大、流速快。但它与水的亲和力较小，具有较强的疏水性，容易引起蛋白的变性。故一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。以纤维素（Cellulose）、球状纤维素（Sephacel）、葡聚糖（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）为基质的离子交换剂都与水有较强的亲和力，适合于分离蛋白质等大分子物质，葡聚糖离子交换剂一般以Sephadex G－25和G－50为基质，琼脂糖离子交换剂一般以Sepharose CL－6B为基质。关于这些离子交换剂的性质可以参阅相应的产品介绍。
2. 离子交换剂的电荷基团
根据与基质共价结合的电荷基团的性质，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。
阳离子交换剂的电荷基团带负电，可以交换阳离子物质。根据电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型和弱酸型三类。它们的区别在于它们电荷基团完全解离的pH范围，强酸型离子交换剂在较大的pH范围内电荷基团完全解离，而弱酸型完全解离的pH范围则较小，如羧甲基在pH小于6时就失去了交换能力。一般结合磺酸基团（?SO3H），如磺酸甲基（简写为SM）、磺酸乙基（SE）等为强酸型离子交换剂，结合磷酸基团（?PO3H2）和亚磷酸基团（?PO2H）为中等酸型离子交换剂，结合酚羟基（?OH ）或羧基（?COOH），如羧甲基（CM）为弱酸型离子交换剂。一般来讲强酸型离子交换剂对H离子的结合力比Na+离子小，弱酸型离子交换剂对H离子的结合力比Na+离子大。
阴离子交换剂的电荷基团带正电，可以交换阴离子物质。同样根据电荷基团的解离度不同，可以分为强碱型、中等碱型和弱碱型三类。一般结合季胺基团（?N(CH3)3），如季胺乙基（QAE）为强碱型离子交换剂，结合叔胺（?N(CH3)2）、仲胺（?NHCH3）、伯胺（-NH2）等为中等或弱碱型离子交换剂，如结合二乙基氨基乙基（DEAE）为弱碱型离子交换剂。一般来讲强碱型离子交换剂对OH?离子的结合力比Cl?离子小，弱酸型离子交换剂对OH?离子的结合力比Cl?离子大。
3. 交换容量
交换容量是指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。通常所说的离子交换剂的交换容量是指离子交换剂所能提供交换离子的总量，又称为总交换容量，它只和离子交换剂本身的性质有关。在实际实验中关心的是层析柱与样品中各个待分离组分进行交换时的交换容量，它不仅与所用的离子交换剂有关，还与实验条件有很大的关系，一般又称为有效交换容量。后面提到的交换容量如未经说明都是指有效交换容量。
影响交换容量的因素很多，主要可以分为两个方面，一方面是离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及所分离的样品组分的大小等的影响。这些因素主要影响离子交换剂中能与样品组分进行作用的有效表面积。样品组分与离子交换剂作用的表面积越大当然交换容量越高。一般离子交换剂的孔隙应尽量能够让样品组分进入，这样样品组分与离子交换剂作用面积大。分离小分子样品，可以选择较小孔隙的交换剂，因为小分子可以自由的进入孔隙，而小孔隙离子交换剂的表面积大于大孔隙的离子交换剂。对于较大分子样品，可以选择小颗粒交换剂，因为对于很大的分子，一般不能进入孔隙内部，交换只限于颗粒表面，而小颗粒的离子交换剂表面积大。
另一些影响因素如实验中的离子强度、pH值等主要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。一般pH对弱酸和弱碱型离子交换剂影响较大，如对于弱酸型离子交换剂在pH较高时，电荷基团充分解离，交换容量大，而在较低的pH时，电荷基团不易解离，交换容量小。同时pH也影响样品组分的带电性。尤其对于蛋白质等两性物质，在离子交换层析中要选择合适的pH以使样品组分能充分的与离子交换剂交换、结合。一般来说，离子强度增大，交换容量下降。实验中增大离子强度进行洗脱，就是要降低交换容量以将结合在离子交换剂上的样品组分洗脱下来。
