第三种可以编辑人类细胞基因组的CRISPR-Cas系统
CRISPR-Cas系统为细菌和古菌抵抗外界病毒入侵的适应性免疫，基于此已开发出了两套基因编辑系统： CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a（Cpf1）。它们能有效地编辑动植物的基因组，极大地推动了基因编辑相关领域的发展【1】。但Cas9系统存在脱靶效应、Cas9和Cas12a蛋白的尺寸太大，是否能找到尺寸更小、特异性更高的效应蛋白对整个基因编辑领域意义重大，尤其是治疗性基因编辑方面的应用。
北京时间1月23日，来自MIT的张峰团队在Nature communication上发表了题为Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome的研究论文，开发了第三种基因编辑工具CRISPR-Cas12b，该工具经过改造后也能在哺乳动物和人体中进行有效的基因编辑。
早先报道核酸酶 (AacCas12b)保持体外切割活性的温度范围是40℃至55℃，这不适合于哺乳动物基因组编辑【2】。研究人员用BLAST找出了27个V–B型的Cas12b蛋白，排除了来源于嗜热菌和先前研究过的还剩14个候选者，最终发现四个Cas12b (AkCas12b、BhCas12b、EbCas12b、LsCas12b)可能有活性。体外实验表明，AkCas12b和BhCas12b在37℃仍具有较强的DNA切割活性，把tracrRNA和crRNA融合成一个sgRNA后也能保持切割活性。
三种基因编辑工具：Cas9、Cas12a（Cpf1）和Cas12b
有意思的是，这两个核酸酶在细胞系也能检测到切割活性，虽然插入缺失突变的比例不到1%。为了提高在细胞内的切割效率，研究人员首先优化了相应的sgRNA序列，发现BhCas12b的切割活性提高了30倍。研究人员进一步发现AkCas12b和BhCas12b倾向于在DNA非靶向链上产生缺口，提示可能是由于Cas12b结构比较紧凑，影响了靶向链进入RuvC活性中心。AacCas12b与DNA复合物的晶体结构揭示了RuvC活性中心与DNA底物互作的关键氨基酸。为了提高BhCas12b与DNA的亲和力和切割活性，作者测试了176个突变体，发现K846R 和S893R能显著提高切割活性。
适冷酶表面富含甘氨酸，这增加了蛋白的柔性和酶活【3】。为了进一步提高BhCas12b的酶活，研究人员测试了66个BhCas12b表面的氨基酸替换成甘氨酸突变体的酶活，发现突变体E837G（位于gRNA:DNA 双链和RuvC活性中心之间）能至少提高两倍的酶活。
综上，研究人员构建了酶活最高的突变体BhCas12b v4（K846R/S893R/E837G），它有以下几个优点：（1）酶活与SpCas9、AsCas12a相当，但特异性比更SpCas9更高，其安全性更适合于临床应用；（2）在基因组里PAM数量与AsCas12a相当，扩大了基因组的靶向范围；（3）蛋白更小（BhCas12b：1108个氨基酸、SpCas9：1369个氨基酸、AsCas12a：1353个氨基酸），尤其适合用于腺相关病毒AAV介导的基因治疗。因此，该系统具有极大的应用前景，有望开发出新一代安全高效的基因编辑工具。
特别值得一提的是，不久前（2018年11月27日）来自中科院动物所李伟课题组在Cell Discovery杂志上发表了题为Repurposing CRISPR-Cas12b for mammalian genome engineering的相似研究成果，同样鉴定出了一个名为Cas12b（又称为C2c1）的新CRISPR系统，能够编辑人类细胞基因组并应用于制备动物疾病模型【4】。据悉，针对这项新技术，该研究团队已于一年前提交了ZL申请，并正在开发这项技术在基因治疗中的应用。
参考文献：
1. Hsu PD, Lander ES, Zhang F: Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering. CELL 2014, 157,1262-1278.
2. Shmakov S, Abudayyeh OO, Makarova KS, Wolf YI, Gootenberg JS, Semenova E, Minakhin L, Joung J, Konermann S, Severinov K et al: Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems. MOL CELL 2015, 60,385-397.
3. Mavromatis K, Tsigos I, Tzanodaskalaki M, Kokkinidis M, Bouriotis V: Exploring the Role of a Glycine Cluster in Cold Adaptation of an Alkaline Phosphatase. Eur J Biochem 2002, 269,2330-2335.
4. Teng, F., Cui, T., Feng, G., Guo, L., Xu, K., Gao, Q., ... & Li, W. (2018). Repurposing CRISPR-Cas12b for mammalian genome engineering. Cell discovery, 4(1), 63.
