总RNA提取实验
实验方法原理 GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用，将促使核蛋白复合体的解离，使RNA 与蛋白质分离，并将RNA 释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA ，则根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法进行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA 进入水相，这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA 可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA 沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA 中如含无机盐，则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。
实验材料 微生物动物细胞植物组织
试剂、试剂盒 RNA 提取试剂盒焦碳酸二乙酯乙醇
仪器、耗材 恒温水浴冷冻高速离心机紫外分光光度计取液器电泳仪电泳槽
实验步骤
一、细胞或组织破碎
1. 微生物材料
（1）发酵3~4天（或对数生长期）的菌体，离心收集菌丝体（动植物材料无需此步处理）。
（2）用经DEPC处理的水洗菌丝体2~3次，并尽量除去残存的水。
（3）加液氮充分研磨，使其成为粉末，以释放RNA。
（4）研磨后的样品转移至12 ml 变性液的容器中匀浆。
2. 动植物细胞培养材料 （适用的样品量为细胞：108）
（1）细胞或组织培养：按常规方法进行。
（2）深层悬浮培养细胞的破碎。
①细胞收集：含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中，4℃，3 000 g 离心5分钟。
②细胞洗涤：上步沉淀用25 ml 灭菌后冰冻的1×PBS缓冲液洗涤，然后4℃，3 000 g 离心5分钟。
③细胞破碎：在沉淀细胞中加入15 ml 预冷的变性液，用无菌处理过的匀浆器匀浆。
3. 表面培养细胞的破碎
（1）确定培养瓶数量，使选定的各培养瓶细胞累加后总量达108。
（2）细胞收集：将培养液倒掉，用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤一次，在培养瓶中加入8 ml 预冷变性液。
（3）转动培养瓶，使细胞溶解，此时可见粘度加大。
（4）用无菌吸管将第一个培养瓶中的液体吸入第二个培养瓶，旋转，溶解细胞，再吸入第三个培养瓶，以此类推。
（5）直到将所选定的培养瓶全部洗涤一次，然后从第一个培养瓶开始再加入4毫升上述变性液，将所有培养瓶洗一次。
（6）将上述12 ml 含细胞的变性液转移至一50 ml 无菌离心管中，匀浆破碎细胞。
4. 植物组织破碎 （适用的样品量为0.05 g 组织）
（1）将600 ul 变性液置于1.5 ml 离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。
（2）将0.05 g 新鲜组织用液氮冰冻。
（3）在液氮下，研磨组织块。
（4）待液氮挥发后，将上述分散的组织转移至无菌离心管中。
5. 动物组织破碎 （适用的样品量为1 g 组织）
（1）将12 ml 变性液置于50 ml 离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。
（2）在上述管中加入1 g 新鲜或冰冻动物组织，匀浆粉碎。
二、RNA 的抽提
1. 在经变性液匀浆的细胞或组织600 ul+60 ul pH4.0的2 M 乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器。
2. 600 ul 酚\氯仿\异戊醇（25\24\1），彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。
3. 冰裕中10~15分钟，离心，4℃，10 000 g，20分钟。
4. 上层水相吸至无菌离心管中加等体积的异丙醇，-70℃，30分钟沉淀RNA。
5. 离心4℃，10 000 g，20分钟。
6. 沉淀RNA ，冷冻干燥15分钟 ， RNA 沉淀重新溶于300 ul 变性液中，可振荡（有时为了帮助溶解，可在65℃加热，但时间应极短）。
7. 60 ul pH4.0的2 M 乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器。
8. 600 ul 酚\氯仿\异戊醇（25\24\1），彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。
9. 冰裕中10~15分钟，离心，4℃，10 000 g，20分钟。
10. 上层水相吸至无菌离心管中。
11. 等体积异丙醇二次沉淀（-70℃，30分钟），75%乙醇洗沉淀，沉淀冷冻干燥。
12. 复溶于去RNA 酶的水中（对于准备长期保存的RNA 可加入pH 5.0的乙酸钠至终浓度为0.25 M，再加入2.5体积的乙醇，-70℃保存。）。
注意事项
1. 研磨组织块用于RNA 提取的样品，必须是新鲜的细胞或组织，如采样后，不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70℃的冰箱中保存。
2. 变性液及相应的离心管需预冷。
其他
1. 变性液组成
25 g异硫氰酸胍溶于33 ml CSB(42 mM pH4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2 mM β-巯基乙醇)，65℃溶解，过滤灭菌，4℃预冷。
2. 酸性酚配制
55℃时，500 g酚溶入500 ml 50 mM，pH4.0乙酸钠，混匀，静止分层后，去上清，再反复加500 ml 50 mM，pH4.0乙酸钠，直到pH<4.1。
