免疫金银染色双PAG法
实验概要
本实验介绍了免疫金银染色双PAG法的操作步骤。
实验原理
免疫金银染色方法敏感、简便、省时、安全可靠，葡萄球菌A蛋白(SPA)金标记四步法是在此基础上发展起来的更为敏感的一种新方法。SPA和许多哺乳类动物IgG具有亲和性，且它们之间的连接不会干扰抗原—抗体的结合。简单的SPA金标记二步法后，第三步用抗SPA与SPA金表面分子通过Fab或Fc段相结合，结果结合更多的胶体金颗粒，再通过银增强，使原始信号得到几何级放大，其染色原理见图。
实验步骤
1. 石蜡切片常规脱蜡至水，0.05mol/L(pH7.4)TBS洗3×3min。
2. 0.1％胰蛋白酶37℃消化20min，或抗原修复20min(98℃)，自然冷却至室温。
3. 0.05mol/L(pH7.4) TBS洗3×3min。
4. 1%EA(卵蛋白)15min，不洗。
5. 适当稀释的特异抗体室温4h或4℃孵育20h，或37℃孵育30min。
6. 0.05mol/L(pH7.4)TBS洗3×5min。
7. 0.02mol/L(pH7.4)TBS(内含0.1％BSA)洗10min。
8. 1％EA 15min，不洗，滴加PAGlonm 1:40稀释，室温1h，
9. 0.05mol/L(pH7.4)TBS洗10min。
10. 兔抗SPAIgG l:400稀释，37℃ 30min。
11. 0.05mol/L(pH7.4)TBS洗10min。
12. 滴加PAGlonm 1:60稀释，室温1h，或37℃ 30min。
13. 0.05mol/L(pH7.4)TBS洗10min。
14. 1％戊二醛洗10min。
15. 双蒸水洗5min。
16. 1％明胶洗5min。
17. 银避光显影8～15min。
18. 双蒸水洗15min。
19. 固定：用显影定影液(1:4或1:10)固定5min，也可以用15％硫酸钠-20％硫代硫酸钠混合液固定1～3min，或用1％戊二醛固定5min，50℃温水洗3～6min。
20. 衬染：核固红衬染3min或甲基绿衬染3min。
21. 常规脱水，树胶封片。
22. 镜检：阳性物质呈黑色或黑褐色，颗粒分布于抗原—抗体反应部位；背景较干净，呈红色。
