机体细胞免疫功能的检测
实验概要
本实验用硝基蓝四氮唑还原法检查了机体细胞的免疫功能。硝基蓝四氮唑，又称四唑氮蓝(nitroblue tetrazolium, NBT)，是一种水溶性的淡黄色活性染料，当其被嗜中性白细胞的酶还原后，则变为非水溶性的蓝黑色甲月替(Formazan)颗粒,沉淀于胞浆内。当机体受细菌、真菌和寄生虫感染时，嗜中性白细胞的吞噬能力明显增强，还原NBT的能力亦随之增高，但病毒性感染或非感染性疾病则不增高，故可利用NBT还原试验作为诊断全身性感染的一种辅助方法，并作为判定嗜中性白细胞杀菌功能的指标，以诊断吞噬功能缺陷症。一般认为在细菌感染过程中，嗜中性白细胞能量消耗骤增，氧的消耗量增加，己糖磷酸旁路糖代谢活性加强，葡萄糖分解的中间产物葡萄糖6磷酸在此旁路中脱氢氧化而成为戊糖。所脱出的氢被吞入或渗入胞浆内的NBT接受，则还原成为点状或块状的蓝黑色甲月替颗粒颗粒，沉积于细胞浆内。
主要试剂
1． 0.2% NBT溶液取10mg NBT置于棕色瓶内，加入5ml生理盐水，于室温下摇动1h，或放80℃水浴中搅拌或振荡，促其溶解。溶液呈淡黄色，清亮，少量不溶的颗粒静置后沉于瓶底，用时吸上清液。为避免不溶性颗粒(沉渣)影响试验结果，亦可用滤纸将其过滤，置于4℃冰箱保存，有效期3～6个月。
2． 0.15mol磷酸盐缓冲液(pH值7.2)取7.6g Na2HPO4及2.48g KH2PO4，加入适量生理盐水，使其容积成500ml，调整pH值为7.2;亦可按每ml磷酸盐缓冲盐水加入1mg葡萄糖。混匀，过滤，113℃高压灭菌20min，分装，置4℃冰箱保存备用。
3． NBT应用液取上述0.2% NBT溶液与0.15mol磷酸盐缓冲液等量混合。应用时现配。
4．肝素溶液每ml含126单位。
5． 1%沙黄(Safranin O)水溶液取沙黄1g，先加入1～2ml 95%酒精，边振荡边加入98ml蒸馏水，使之逐渐溶解，过滤，滤液分装于玻璃瓶内，室温保存。
主要设备
小玻璃瓶，也可用青霉素瓶代替，每瓶加入1ml含126单位肝素0 1ml(即126单位)，加塞；小试管或凹玻片；毛细滴管；吹风机等。
实验步骤
1．取静脉血0.5~10ml，每ml按126单位加入肝素抗凝，肝素量不宜过大，否则会引起假阳性反应。
2．取上述抗凝血0.1ml，加入等量的NBT应用液，放入一凹玻片中，或放入12×75mm 塑料管或小试管，混匀，将管口盖上。凹玻片可放于一浸湿纱布之平皿中，加盖，置37℃温箱，孵育25min，然后放室温15min。试管可放37℃温箱，其间振摇一次。孵育的方式很重要，如放置水浴中将会增加染料的还原能力。
3．将上述液体取出摇匀，用毛细滴管吸取1滴于玻片的一端作推片，要求推出尾部，推片要厚薄适宜。
4．立即用吹风机吹干，甲醇固定1~2min，吹干，用1%沙黄水溶液染色5min，也可用5%甲基绿水溶液染色15min，或用姬姆萨瑞氏染液染色，自来水冲洗，吹干，油镜观察，计数。
5. 结果判定
1) 计数
a． NBT阳性细胞的百分率计算100个嗜中性白细胞中NBT阳性细胞数。
b． NBT阳性细胞总数NBT阳性细胞%×多核白细胞%×白细胞总数。故应同时推片作白细胞计数及分类，以计算出阳性细胞的绝对值，以避免误差。计数时，应注意不要将聚集的或破坏的多核白细胞及单核细胞计算在内。
c．沉着的甲月替颗粒形状不一，有的呈大块状，有的呈点状或放射状。必须注意，单核细胞还原NBT的能力也很强，不应将其计算在NBT阳性细胞内。因此涂片要涂得较薄，以便清楚地看到甲月替沉着物，并能更好地区别嗜中性白细胞及单核细胞。
2) 结果判定若血涂片中有10%以上的嗜中性白细胞能还原NBT，即为阳性反应。
注意事项
1. 要设对照NBT还原是吞噬细胞内多种酶引起的，必须用在0℃下的细胞作对照，借以排除因细胞溶解或其他原因释放的酶所引起的非特异性反应。
2. 注意吞噬细胞代谢因素对试验结果的影响因NBT还原与吞噬过程在时间上是一致的，所以要注意掌握染料开始被还原的时间(30min以内)，才能得到准确的结果。
3. 要除掉染料中未溶解的颗粒NBT染料在盐水中不易溶解，故应注意除掉未溶解的染料颗粒，否则被吞噬细胞吞噬，将会影响试验结果。
