细胞污染的种类分辨和应对方法
学会正确地进行细胞培养是细胞实验的基础，然而小心翼翼的你，怎奈何体外细胞的脆弱，百密终有一疏。你偶然的一个喷嚏，不经意得捋捋你的头发丝，对于这些丢失体外抵抗能力的细胞都可能是毁灭性的灾害。但是，并非所有的细胞污染都是致命的，若是及时发现，还是可以得到挽救的。今天咱们的主题就是：教大家辨别各种细胞污染及如何应对。
如下图：实验室常见的细胞污染，你都知道属于哪种污染吗？
细胞培养中的常见污染主要包括：细菌、霉菌、支原体、黑胶虫、病毒和交叉污染等，每一种污染都有各自的特点。如细菌和霉菌增殖迅速，短时间就对细胞造成明显伤害；而支原体和病毒对细胞的影响则是一种缓慢长期的过程。下面就具体看看每一种污染。
1. 细菌污染（较容易被发现）
引起原因：操作不规范或无菌措施不到位等；
细菌污染种类：白色葡萄球菌，大肠杆菌，假单孢菌、枯草杆菌等；
细胞污染后的变化：
①污染后由于有大量酸性物质产生，因此培养基会短时间内由红色变为黄色；
②由于细菌大量增殖，培养基变浑浊，稍微振荡后可见培养基表面有漂浮物；
③普通倒置显微镜高倍镜观察，胞浆内可见大量颗粒（如下图红色箭头）；
④细胞生长缓慢，逐渐变圆脱落。
如下图所示：左：悬浮细胞污染后，可见悬浮细胞个体远大于杆状细菌，而细菌呈黑色颗粒状并会有较快的运动速度；右：贴壁细胞，可看到球状细菌分布于细胞周围并做剧烈运动。
细菌污染的细胞（左悬浮细胞，右贴壁细胞）
图片来源：UNC School of Medicine
处理措施：
在培养液中添加双抗（P/S）处理；可用抗生素的常用量的5~10倍作冲击疗法，用药24~48h后再换常规培养液；
另外添加西司他丁钠和亚胺培南（泰能）处理细胞，适用于培养用具被打翻、使用了污染的培养液或要培养污染的组织或者冻存细胞的污染情况[1]。
裸鼠体内接种法是比较有效和彻底的除菌方法。主要包括腹水接种和皮下荷瘤分离细胞。既能彻底清除污染细菌，又能保持肿瘤细胞的来源特征和恶性特性。对于一些特别珍贵的肿瘤细胞，可采用裸鼠体内接种法[2]。
2. 霉菌污染（较容易被发现）
引起原因：操作不规范或无菌措施不到位等；
污染种类：白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，曲霉菌，孢子菌等；
细胞污染后的变化：
①一般来说，培养液不会变浑浊；
②比较容易发现，肉眼可见点状菌落（淡黄色或者白色）漂浮在培养基表面（如下图左）；
③普通倒置显微镜下观察，可见絮状交错的菌丝或菌团生长在细胞之间；有时真菌并不是直接分布于细胞贴壁层，需要通过调整显微镜仔细观察寻找菌丝或菌团（如下图右）。
如下图所示：悬浮细胞U397的霉菌污染，黄色圆形发亮的是U397；红色箭头：霉菌的菌丝和孢子囊，特别的是孢子释放出来后是难以被酒精杀死。
霉菌污染后的悬浮细胞（图片来源InCelligence网站）
处理措施：
添加制霉菌素和两性霉素B，但是对细胞的毒性也较大；
环境彻底消毒：先后用酒精、新洁尔擦洗培养箱；水盘加上饱和量的硫酸铜。
若细胞不是特别珍贵，建议丢弃。
3. 支原体污染（难被发现）
支原体是一种自然界中能独立生活的最小微生物，能通过细菌滤器，在细胞培养过程中，支原体感染发生率很高[3]。由于支原体可以与细胞共存，生长速率受影响较小，而被忽视。支原体污染在细胞培养污染中最为隐蔽和最难察觉，但是支原体能明显影响宿主细胞代谢、RNA合成及基因表达的作用，因此越来越受到重视。
引起原因：主要来源于是已感染支原体细胞之间的交叉污染，支原体感染的血清和胰酶等；
细胞污染后的变化：
①培养液不变浑浊，但会很快变成黄色；
②多数细胞在形态方面少有明显变化；
③在倒置显微镜下可见胞浆出现小颗粒或空泡；
如下图：支原体个体很小，需要使用透射电镜才能清晰看到其结构及分布，图中红色箭头即为支原体，其分布在细胞周围。
支原体污染后的透射电镜图[4]
处理措施：
定期用支原体试剂盒检测；
换液可以减缓污染情况，但无法根除；
支原体清除试剂盒可以达到较好效果；
小鼠腹腔巨噬细胞清除法。
4. 黑胶虫污染
引起原因：往往来源于血清；
细胞污染后的变化：
①低倍镜下观察时可见黑色小点，高倍镜下可见到其做布朗运动，像小虫游来游去；
②细胞培养液仍然清亮，污染较轻时对细胞无影响；若太多就会对细胞造成影响。
如下图：红色箭头所示黑胶虫分布于细胞间。
黑胶虫污染后的细胞[5]
处理措施：
更换血清；增加细胞密度，提高细胞的生长率。
5. 病毒污染
引起原因：病毒可能来自于血清；
细胞污染后的变化：
①污染后培养液无明显变化；
②大部分细胞也不会有明显的形态变化；
6. 交叉污染
引起原因：两种或两种细胞以上的实验同时进行，实验器具、试剂等混用而易造成的污染；
检测手段：可通过镜检观察细胞形态是否与所培养细胞形态一致来判断，另外还可以通过各种免疫学试验、同功酶分析及细胞遗传学方法来确定。
处理方式：针对病毒和交叉污染较难清除，建议丢弃细胞重新培养；
看到这里，文章开头的那几张图片代表着什么污染，你能辨别了吗？可以在下方给我们留言，看看你是否掌握了这项技能哦！
学会对各种污染情况的辨别和处理是一项不可或缺的实验技能，希望大家在看完我们的文章后结合你的实验操作，学会如何应对细胞污染。
参考文献：
1.江千里, 王健民, 江汕,等. 西司他丁钠+亚胺培南消除细胞培养中细菌污染的研究[J]. 第二军医大学学报, 2004, 25(1):114-115.
2.王鸿、张伟、孟娜. 细胞培养中珍贵贴壁细胞污染挽救方法的评价[J]. 首都医科大学学报, 2011,26 (1):1006-7795.
3.Olareringeorge A O, Hogenesch J B. Assessing the prevalence of mycoplasma contamination in cell culture via a survey of NCBI's RNA-seq archive[J]. Nucleic Acids Research, 2015, 43(5): 2535-2542.
4.Shlomo R, Nechama S K, Jonathan D K,. Contamination of Tissue Cultures by Mycoplasmas. DOI: 10.5772/51518
5.辛颜彬．细胞培养污染的发生、预防及清除［J］．军事医学科学院院刊，1989，13( 6):468-470．
