直接ELISA法
实验概要
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
实验步骤
1. 包被抗原
1) 用 PBS 或碳酸盐缓冲液稀释抗原至终浓度 20 μg/ml。用移液器吸取 50 μl 稀释抗原到 PVC 酶标板上，按要求往后进行系列稀释。
2) 酶标板上覆盖封口膜，室温孵育 2 小时，或者 4 °C 过夜。孵育时间需要优化。
3) 倒掉孵育溶液，用 PBS 洗板 2 次，每孔 200 μl。在水池上轻甩倒掉洗液，在纸巾上轻拍酶标板除去残留液体。
2. 封闭
1) 用含 5% 脱脂奶粉或含 5% 血清的 PBS 缓冲液封闭酶标板上剩余的蛋白结合位点，每孔 200 μl。或者用其他封闭剂如 Block ACE、BSA（牛血清蛋白）代替。
2) 封口膜覆盖酶标板室温至少孵育 2 小时，或者 4 °C 过夜。
3) PBS 洗板 2 次。
3. 加抗体孵育
1) 加入抗体，每孔 100 μl，稀释到最佳浓度（参照厂家推荐），使用前用封闭液现配。
2) 封口膜覆盖酶标板室温孵育 2 小时，孵育时间需要进行优化。通常 2 小时孵育即可获得足够强的信号，但如果获得的信号较弱时，可4 °C 孵育过夜获得较强信号。
3) PBS 洗板 4 次
4. 检测
1) 用多通道吸液器加入底物，每孔 100 μl（或 50 μl）。
2) 显示出足够深的颜色后，加终止液（如有必要），每孔 100 μl。
