一种快速有效的基因分型斑马鱼的方法（三）
Fig.3.
通过高分辨溶解曲线进行逆转录病毒插入突变wdr43hi821a进行基因分型。A：wdr43hi821a的基因组。B：野生型和突变等位基因的DNA序列。下划线标注的是引物序列。野生型的Tm值为73.0℃，突变型的Tm值为81.1℃。C：从wdr43hi821a/+得到的48个晶胚的DNA样品的PCR产物的溶解曲线。聚类后蓝色的为野生型样本，红色曲线为突变样本，黑色为杂合样本。
讨论
通过高分辨溶解曲线（HRMA）很容易就区分出了斑马鱼中三种不同类型的突变。与其他方法相比该技术有许多优点。所用的时间和PCR所必备的程序明显少于其他方法。PCR可以快速进行，而且溶解曲线的分析要快于进行琼脂糖凝胶电泳。无需使用稀有的和昂贵的限制性内切酶。PCR的有效性和特异性高，可以去除进行下游分析的不确定性，例如进行酶切就容易出错。
尽管我们在斑马鱼中应用了该技术，HRMA还可以用于其他模式生物中。从任何生物中得到的DNA都可以进行HRMA。大多数小鼠的基因分型都要敲除等位基因，这里也可以用HRMA这种方法进行基因分型以及插入突变的分析。SNP/小缺失检测的方法可以用于检测不太频繁的小鼠missense
or
floxed的等位基因。类似于斑马鱼，线虫（C.eleagans）和(D.malanoganster)主要突变的点突变，小的缺失或插入。此外，本研究中描述的这种方法需要从任何生物中提取DNA。因为高分辨溶解曲线分析的灵敏度可以允许检测单核苷酸的差异，因此通过扫描整个基因可以找到突变的位置。大的人类基因例如BRCA1（van
der Stoep et al., 2009）和CFTR（Montgomery et al.,
2007）通过扫描的方法比测序要更有效。人类（Liew et al., 2004）和植物（McKinney et al.,
2009）的基因分型以及微生物物种分析都可以应用。
TILLING这项技术曾应用于斑马鱼中经过ENU诱变的特定基因的突变鉴定（Till
et al.,
2003）。这一技术涉及到使用稀有的，异源双链分子特异性酶Cell1的酶切，来检测不配对的DNA，随后还要进行凝胶切割和成像。这种方法不仅繁琐而且需要昂贵的设备。类似于人类突变的扫描，其他基因也可以使用HRMA技术扫描得到可靠的结果而且要比TILLING花费少且节省时间。
该技术的一个限制就是要使用LightScanner。不过也可以在灵敏度较低的一起上进行HRMA，例如Roche
LightcycleVR480或Qiagen Rotor-Gene
Q，只要PCR产物可以容纳总够的Tm值差异。此前发表的数据显示不同的仪器可以不同灵敏度下检测PCR产物的溶解差异(Herrmann et
al., 2006, 2007a,b; Reed et al., 2007)。HRMA的应用范围将继续增加（Vossen et al.,
2009）。该技术已经成为我们实验室进行动物模型基因分型最有效的方法，并且在突变扫描方面也是非常有价值的技术。
实验方法
DNA提取
晶胚或Tail-clip放置于96孔板中，去除晶胚中的水，然后在每个孔中加入100µL的ELB（10mM
TRIS pH8.3, 50mM KCl, 0.3% Tween 20, 0.3% NP40, 1 mg/mL Prot
K）,55℃培养4hr 至过夜，这根据样品的大小决定。板95℃加热15min已钝化蛋白酶K。
PCR和溶解曲线分析
引物设计，HRMA可以依据不同纯合扩增子Tm值得差异来区分不同的基因型（Liew
et al.,
2004）。这种差异可以使用任何一种软件包的邻近参数来估算Tm值。除此之外，引物设计没有特定的要求，使用任何引物设计软件都可以。点突变的引物设计可以使用Lightscanner引物设计软件（Idaho
Technology）。然而对于小的缺失或插入，可以手动设计引物，然后使用Vector
NTI程序来预测产物的Tm值（Invitrogen）。PCR可以在MJ Research
96孔PCR仪上进行。所有的反应使用96孔板（BioRad HSP9665）。SNP检测和小的缺失的PCR反应程序是：95℃
15sec，然后95℃ 2sec，60℃ 2sec，72℃ 2sec（40 cycles）。之后95℃
10sec,4℃冷却，4℃保存。逆转录病毒插入检测的PCR反应程序是：95℃ 15sec，然后95℃ 2sec，60℃ 2sec，72℃
4sec（35cycles），随后72℃ 30sec，4℃冷却，4℃保存。PCR试剂：1×ExTAQ PCR buffer，1×
dNTPs（250 µM each），1× LC Green Plus，0.5µM 引物，1µL 基因组DNA，0.25U
ExTAQ，10µL反应体系。PCR结束后在LightScanner上65-95℃进行溶解曲线分析（Idaho
Technology）。升温速率为0.1℃/sec。使用LightScanner软件进行溶解曲线的归一化后进行分析（Wittwer et
al., 2003）。基因分型全部由软件自动化完成（Palais and Wittwer,
2009）。96孔板的溶解大概需要10min，基因分型不到5min。
PCR引物
• P53 FWD (F3): GCGCCTGCTGGTCA
• P53 REV (F4): CTGATTGCCCTCCACTCTT
• APC FWD (F29): CCACTAATAATGTTGCAGCTGA
• APC REV (F30): GACTGATGATTGGCTCTCAGA
• BAP28 FWD (K73): AAAGAGGTCAACAAGAAACTG
• BAP28 REV (K74): TGAGGAAGAGAGAAATGCTC
• WDR43 FWD (K51): ACAAGATTCTTAAGGGATAAAGT
• WDR43 REV (K56): GTAAATCATCATTAACATCTATTACC
• VIRUS REV (K53): GAGTGATTGACTACCCGTCAG
• WDR43 FWD (SG9): CCATCCTCATCTACAGCACACTGA
• WDR43 REV (SG112): GGGTTAATGGGACCAACTGA
• VIRUS REV (SG22): GTTCCTTGGGAGGGTCTCCTC
