HPLC法测定谷物中黄曲霉毒素含量

2019.9.17

方案优势

定量准确，精密度高而且操作极为方便。

采用标准

国家相关标准

方法/原理/步骤

　　标准品的准备

　　标准品包括了黄曲霉毒素B1、G1、B2、G2各单一标准液和混合标准液，溶剂为乙腈，黄曲霉素混合标准液的浓度为2μg/ml B1、G1以及0.5μg/ml B2、G2。单一标准液用来确定各自的保留时间，具体工作用混合标准液是将所提供标准液稀释10倍，用微量注射器分别取5.0、10.0、20.0、25.0、40.0、50.0μl稀释标准液(具体浓度为200ng/ml的B1、G1；50ng/ml的B2、G2)，和样品一样蒸干，用三氟乙酸衍生，定容于0.2ml流动相，故所得进针的浓度分别是：B1、G1为5.0、10.0、20.0、25.0、40.0、50.0ng/ml；G2、B2为1.25、2.5、5.0、6.25、10.0、12.5ng/ml。

　　样品

　　实验所用样品包括玉米、小麦等，取代表样品5kg，粉碎，充分混合均匀，四分法缩至500g。因霉菌毒素分布不均匀，充分混合非常重要，必要时取样量加大(有地方建议取15kg)。

　　样品的提取和净化

　　使用粉碎机将样品研细，称取25g研细样品置于250ml的烧瓶或搅拌瓶中。加入100ml乙腈-水(体积比84：16)溶液。在旋转震荡器上震荡1h。用漏斗、定性滤纸将其过滤到样品瓶中。转移8ml样品提取液通过PuriToxSR160真菌毒素多功能净化柱，推出大约4ml的净化液(具体过程见图1)，转移2ml已净化的提取液至洁净的棕色瓶。在水浴60℃条件下用氮气吹干。

　　标准曲线及回归方程

　　按实验方法进行测定，4种黄曲霉毒素的标准曲线、回归方程及检出限(按3倍信噪比计算)的测定结果。

　　样品的加标回收实验

　　取玉米样品一份，分别做两个浓度的加标回收实验。具体做法是：取8ml黄曲霉素空白样的提取液,分别加10μl和25μl黄曲霉素混合标准液(1 000ng/ml黄曲霉素B1、G1以及250ng/ml黄曲霉素B2、G2)作为加标。经过和样品一样的处理,得出其最后的理论浓度见下式。

　　①B1、G1浓度：(0.010ml×1 000ng/ml)/8ml×（2ml/0.2ml)=12.5ng/ml；

　　(0.025ml×1 000ng/ml)/8ml×（2ml/0.2ml)=31.25ng/ml。

　　②B2、G2浓渡：

　　(0.010ml×250ng/ml)/8ml×（2ml/0.2ml)=3.125ng/ml；

　　(0.025ml×250ng/ml)/8ml×（2ml/0.2ml)=7.812 5ng/ml。

　　精密度实验

　　按实验方法进行样品处理，对同一样品连续测定5次。

仪器设备

　　试剂和仪器

　　乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、叠氮化钠(分析纯)、去离子水、PuriToxSR160真菌毒素多功能净化柱、高效液相色谱仪、2475荧光检测器。

　　柱前衍生及液相色谱条件

　　向剩余物中加入200μl正己烷、100μl三氟乙酸，立即旋紧盖子。涡旋30s，在40℃烘箱中衍生15min，室温下氮气吹干混合物，用200μl水-乙腈(体积比85：15)溶解残余物并涡旋30s，将其转移到1.5ml的离心试管中以10 000r/min的速度离心5min，把已经制备净化好的150μl样品液转移到HPLC样品瓶，进样25μl。