做人外周血流式相关问题
在下最近作人外周血流式，作表面及其胞内染色，试剂说明书说要先分离外周血单个核细胞再染色，我有时候分的红细胞比较多，其他的方法试过了，都改进的不好，我担心红细胞会有影响，想在分离出PBMC以后如果红细胞比较多的话，就用红细胞裂解液裂解一下，但是我有如下问题，希望这样做过的同志指点一下，感激不禁。
（1）有人这样在分离PBMC以后再裂解的吗（我知道一般是在全血染色后再裂解红细胞）？
（2）这样会影响流式检测吗？
（3）用的裂解液配方是什么（最好是自己用过的）。
（4）用法是什么｛我是在如果PBMC分出来以后要是红细胞比较多的时候使用，这样要怎样把分出的PBMC稀释，加多少裂解液 裂解多长时间，裂解后洗涤几次等等｝。
我曾做骨髓液分离单个核细胞而后做流式，一般来说用Ficoll分过之后即便还有红细胞残留，上流式也可通过“设门”根据细胞形态大小将红细胞剔除。若红细胞残留太多，则可通过红细胞裂解液进一步去除之。我用的裂解液配方是：
碳酸氢钾（KHCO3） 1.0g
氯化氨（NH4CL） 8.3g
EDTA-Na2 0.037g 加双H2O至1000ml，为工作液。
配好后4度冰箱保存，使用时效果更好。我是在Ficoll分过之后用的，所以一般根据离心后EP管里细胞团的大小加红细胞裂解液，通常5ml骨髓液分离单个核细胞后得到的细胞再加500ul裂解液，震荡混匀置2－5分钟红细胞就基本上裂解干净了。洗涤次数看白细胞多少而定，因为洗的次数越多，损失就越多。我一般洗一到两次就OK了。做了很久没发现这样处理影响结果。有一点，我是在这样处理后才标记抗体的，楼上的说是标记过才溶红细胞，所以建议在溶的时候时间不宜过长，洗涤次数也不宜过多，以免将标记上的单抗洗脱。
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