微生物纯培养与生长量测定（二）
（四）、选择培养分离
没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。在一种培养基上接种多种微生物，只有能生长的才生长，其它被抑制。如果某种微生物的生长需要是已知的，也可以设计一套特定环境使之特别适合这种微生物的生长，因而能够从自然界混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来，尽管在混杂的微生物群体中这种微生物可能只占少数。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离，是十分重要的，特别对于从自然界中分离、寻找有用的微生物。在自然界中，除了极特殊的情况外，在大多数场合下微生物群落是由多种微生物组成的，因此，要从中分离出所需的特定微生物是十分困难的，尤其当某一种微生物所存在的数量与其它微生物相比非常少时，单采用一般的平板稀释方法几乎是不可能分离到该种微生物的。例如，若某处的土壤中的微生物数量在10８时，必须稀释到10-6才有可能在平板上分离到单菌落，而如果所需的微生物的数量仅为10２-３，显然不可能在一般通用的平板上得到该微生物的单菌落。要分离这种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法。或抑制使大多数微生物不能生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离。
1. 利用选择平板进行直接分离
主要根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件，有多种方法可以采用。例如在从土壤中筛选蛋白酶产生菌时，可以在培养基中添加牛奶或酪素制备培养基平板，微生物生长时若产生蛋白酶则会水解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白质水解圈。通过菌株培养时产生的蛋白质水解圈对产酶菌株进行筛选，可以减少工作量，将那些大量的非产蛋白酶菌株淘汰；再如，要分离高温菌，可在高温条件进行培养；要分离某种抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上进行分离；有些微生物如螺旋体、粘细菌、蓝细菌等能在琼脂平板表面或里面滑行，可以利用它们的滑动特点进行分离纯化，因为滑行能使它们自己和其它不能移动的微生物分开。可将微生物群落点种到平板上，让微生物滑行，从滑行前沿挑取接种物接种，反复进行，得到纯培养物。
2. 富集培养
主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。富集条件可根据所需分离的微生物的特点从物理、化学、生物、及综合多个方面进行选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等等许多方面。如采用富集方法从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。首先配制以对羟基苯甲酸为碳源的液体培养基并分装于烧瓶中，灭菌后将少量的土壤样品接种于该液体培养基中，培养一定时间，原来透明的培养液会变得浑浊，说明已有大量微生物生长。取少量上述培养液转移至新鲜培养液中重新培养，该过程经数次重复后能利用对羟基苯甲酸的微生物的比例在培养物中将大大提高，将培养液涂布于以对羟基苯甲酸为碳源的琼脂平板，得到的微生物菌落中的大部分都是能降解对羟基苯甲酸的微生物。挑取一部分单菌落分别接种到含有及缺乏对羟基苯甲酸的液体培养基中进行培养，其中大部分在含有对羟基苯甲酸的培养基中生长，而在没有对羟基苯甲酸的培养基中表现为没有生长，说明通过该富集程序的确得到了欲分离的目标微生物。通过富集培养使原本在自然环境中占少数的微生物的数量大大提高后，可以再通过稀释倒平板或平板划线等操作得到纯培养物。
富集培养是微生物学家强有力的技术手段之一。营养和生理条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特定微生物的需要。富集培养方法提供了按照意愿从自然界分离出特定已知微生物种类的有力手段，只要掌握这种微生物的特殊要求就行。富集培养法也可用来分离培养出由科学家设计的特定环境中能生长的微生物，尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长。
（五）、二元培养物
分离的目的通常是要得到纯培养。然而，在有些情况下这是做不到的或是很难作到的。但可用二元培养物作为纯化培养的替代物。只有一种微生物的培养物称为纯培养物，含有二种以上微生物的培养物称为混合培养物，而如果培养物中只含有二种微生物，而且是有意识的保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。例如二元培养物是保存病毒的有效途径，因为病毒是细胞生物的严格的细胞内寄生物。有一些具有细胞的微生物也是严格的其它生物的细胞内寄生物，或特殊的共生关系。对于这些生物，二元培养物是在实验室控制条件下可能达到的接近于纯培养的培养方法。
在自然环境中，猎食细小微生物的原生动物也很容易用二元培养法在实验室培养，培养物由原生动物和它猎食的微生物二者组成。例如，纤毛虫、变形虫和粘菌。对这些生物，二者的关系可能并不是严格的。这些生物中有些能够纯培养，但是其营养要求往往极端复杂，制备纯培养的培养基很困难、很费事。
二、微生物生长量的测定
微生物学研究中常常要进行微生物生长量的测定，有多种方法用于微生物生长量的测定，概括起来常用的有以下几种：
（一）直接计数法 ( 又称全数法 )
1 、计数器直接测数法
取定量稀释的单细胞培养物悬液放置在血球计数板 ( 细胞个体形态较大的单细胞微生物，如酵母菌等 ) 或细菌计数板 ( 适用于细胞个体形态较小的细菌 ) 上，在显微镜下计数一定体积中的平均细胞数，换算出供测样品的细胞数。
（ 1 ）血球计数板及细胞计数
血球计数板是一种在特定平面上划有格子的特殊载片。在划有格子的区域中，有分别用双线和单线分隔而成的方格。其中有以双线为界划成的方格 25( 或 16) 格，这种以双线为界的格子称为中格，其内有以单线为界的 16 （或 25 ）小格。因此，用于细胞计数的区域的总小格数为：25×16 = 400 。该 400 个小格排成一正方形的大方格，此大方格的每条边的边长为 1 mm ，故 400 个小格的总面积为 1mm２。
在进行细胞计数前，先取盖玻片盖于计数方格之上，盖玻片的下平面与刻有方格的血球计数板平面之间留有0.1mm 高度的空隙。含有细胞的供测样品液被加注在此空隙中。加注在 400 个小格（ 1mm２ ）之上与盖玻片之间的空隙中的液体总体积应为：1.0mm×1.0mm×0.1mm = 0 . 1mm３
一般表示样品细胞浓度的单位为：亿个 / mL 。因此，在计数后，获得在 400 个小格中的细胞总数，再乘以 10 ４ ，以换算成每 mL 所含细胞数。其计算公式如下：
菌液的含菌数 /mL = 每小格平均菌数× 400 × 10 000 ×稀释倍数
在进行具体操作时，一般取五个中格进行计数，取格的方法一般有两种：① 取计数板斜角线相连的 5 个中格；② 取计数板 4 个角上的 4 个中格和计数板正中央的 1 个中格。对横跨位于方格边线上的细胞，在计数时，只计一个方格 4 条边中的 2 条边线上的细胞，而另两条边线上的细胞则不计；取边的原则是每个方格均取上边线与右边线或下边线与左边线。
