基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF)在...-1
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF)在微生物鉴定中的应用现状
一、简介
质谱（MS）通过分析分子离子的质量电荷比（m/z）来鉴定和定量检测分子。质谱仪内的质谱可以解释为测定一个样本内不同分子的特性。质谱仪可以直接分析任何易电离的生物分子。MS的成功在于几个重要的发现，包括John Fenn发现的电喷雾电离（ESI）和田中耕一发现的基质辅助激光解吸/电离（MALDI）。
基质辅助激光解吸/电离（MALDI）的优势在于其样本与化学基质混合产生离子，使得样本分析前处理工作大大减少。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）结合了两个技术，包括基质辅助激光解吸/电离（MALDI）离子源和飞行时间质谱（TOF）。基于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）的概念，质谱完全改变了临床微生物室中的微生物的鉴定方法，因为它是一个快速、高通量、低成本的以及高效的系统。采用MALDI-TOF MS可节省时间，因为细菌鉴定可以在一小时内完成，而不是24至48小时。这个时间对于潜在的自身免疫性疾病和免疫功能低下的患者是十分重要的。
抗生素敏感性试验（AST）是影响临床治疗的另外一方面关键信息。因此也希望建立基于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）快速可靠的药物敏感性的检测方法。已经开发和验证了几种关于药物敏感性检测的原理, 比如：（1）耐药性菌株生物标志物的检测；（2）抗菌素降解物的质谱检测；（3）稳定同位素（非放射性）标记的氨基酸检测等。但是这些方法都需要进一步优化以便有机会应用于常规检测。
本文将详细讨论基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）的技术背景，包括样本制备和流程。然后介绍基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）在临床微生物鉴定中的应用、产生的毒力因子的分型、以及抗生素耐药性。此外，还讨论其在未来日常临床工作中的应用前景。
二、基于MALDI-TOF MS的微生物鉴定和样品制备
2.1、MALDI-TOF MS概述
MS用于检测质/荷比（m/z比），MALDI-TOF MS提供样本中生物分析物的快速、准确和灵敏的光谱。MALDI是一种电离技术，其中基质吸收紫外线激光的能量从碎片最小的大分子产生离子。m/z比值可以由离子的飞行时间来确定，探测器测量离子飞行时间计算离子质量。
Fig. 1 e MALDI-TOF MS methodology. The sample is co-crystallized with the matrix on the sample target and to be desorbed and ionized by the MALDI ion source (e.g. ultraviolet laser). The ion molecules, including the microbial peptides/proteins, are accelerated by the electric field into the TOF analyzer. All the ions are separated by TOF in accordance with the m/z ratioand a mass spectrum.
a-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）和2,5-二羟基苯甲酸是MALDI基质，用于各种微生物分析。对于微生物鉴定，采用分子量在2000和20000质/荷比（m/z比）之间带正电荷的肽/蛋白。不同种类的细菌间核糖体蛋白的序列和大小是高度保守的，因此可用于鉴定细菌的种类。每一个质谱峰可以用于细菌鉴定，并为细菌指纹提供有价值的信息。为了获得快速、准确、操作简单以及可靠的微生物鉴定，设计出了具有高度自动化操作流程和分析过程的新的质谱系统。
2.2、样本制备
大多数细菌样本分开培养在一个固体琼脂糖培养基上，挑选单一菌落，直接在MALDI靶板上涂抹成一层薄膜。但需要注意，分枝杆菌属和丝状真菌通常需要多个步骤抽提以确保生物蛋白质组的质量，这样可以改进质谱图和鉴定的可信度。对临床急诊病例，采用MALDI-TOF MS可以对原始样本直接进行病原菌鉴定，许多体液样本需要进一步纯化，以便将病原菌与宿主细胞、多肽和蛋白进行分离。不同生物样本需要采用不同的制备方法和鉴定流程以便适应MALDI-TOFMS检测。
Fig. 2 e MALDI-TOF MS microorganism identification workflow in a clinical laboratory. All the bacterial colonies from a standard culture in a solid agar plate are applied directly via the standard smear method. Some liquid samples of urgent specimens, such as blood culture positive bottles and body fluids (CSF or urine), can be applied for direct identification after a multi-step sample preparation and extraction protocol. Mycobacterium spp. are applied following a specific sample preparation protocol for their rapid identification.
2.2.1、临床实验室样本一般制备流程
理想情况下，临床实验室最好采用一种简单、快速、可靠的样品制备方法，完整的细胞质谱，也称为全细胞MS（WCMS），是一种通过MALDI-TOF MS获取微生物蛋白质谱数据的方法。单一细菌或者真菌菌落中的微生物直接涂抹在MALDI靶板上成一层薄膜，然后在上面滴加1微升a-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）（由50%乙腈和纯水配制的2.5%三氟乙酸制备）基质液。这个试剂可以从大多数细菌中抽提蛋白质用于MALDI-TOF MS检测。有些细菌，如分枝杆菌和某些酵母，被肽聚糖或荚膜层包裹，这意味着它们的内部蛋白质不容易被基质液抽提。这些样本建议采用乙醇-甲酸（FA）抽提方法以便产生高质量的质谱图用于鉴定和进一步分析。1接种环细菌加到300微升纯水中，再与900微升纯乙醇混合，震荡几秒钟，以便灭活病原微生物。高速离心2分钟，小心去上清，沉淀中加入总量20至50微升70%甲酸，并充分混合，然后加入等量的纯乙腈并漩涡几秒混匀。高速离心2分钟产生细菌颗粒，将1微升上清液加到MALDI靶板上。样本上滴加用1微升a-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）基质溶液，进行检测。
2.2.2、液体样本
阳性血培养（BC）和各种其他体液主要是液体样本。阳性血培养可能包括血细胞、培养基、树脂或木炭等。去除血细胞和来源于宿主和培养基中的蛋白是MALDI-TO MS样本制备的关键。采用低速离心10分钟的方式去除血细胞，含有细菌的上清液则继续高速离心。去污剂，如皂甙和十二烷基硫酸钠（SDS）也被用来溶解血细胞。真核细胞可以被裂解，但原核细胞不受低浓度去污剂的影响。这个处理步骤可以缩短低速离心去掉宿主细胞的持续时间。也可以采用有欧盟体外诊断试剂注册证的血液培养样本制备试剂盒直接从1.5毫升 阳性血培养（BC）肉汤中进行微生物鉴定。纯化的细菌在MALDI-TOF MS检测前，通过甲酸抽提程序进一步处理。
MALDI-TOF-MS鉴定细菌的敏感性为~104-105CFU大肠杆菌（菌落形成单位），方法敏感性和对纯化培养的要求取决于样本类型。尿标本可直接用于细菌鉴定。尿样本进行流式细胞仪检测以确认是否存在细菌。4毫升阳性尿液样本低速离心（2000Xg）30秒去除白细胞和上皮细胞，然后上清液经过高速离心（15500Xg）5min，收集细菌颗粒。MALDI-TOF-MS分析前用甲酸处理以便抽提细菌蛋白。以前有报道关于采用脑脊液（CSF）对细菌性脑膜炎患者进行病原菌体快速鉴定。用500微升脑脊液进行微生物鉴定。100微升13%十二烷基硫酸钠（SDS）添加到脑脊液中，震荡旋转10秒，然后在13000Xg离心2分钟, 将颗粒重新悬浮在1毫升纯水中，然后在13000Xg离心，MALDI-TOF-MS检测前，用甲酸处理洗涤后的细菌颗粒以便抽提蛋白。
2.2.3、分枝杆菌
近几十年来，分枝杆菌属经历了大规模的分类逆转，目前已经识别菌种有190多种（bacterio.net/mycobacterium.html;Dec.2018)。结核分枝杆菌复合物群（MTC）引起肺结核病（TB）以及全球严重的公共健康问题。2016年，约1040万人结核病，170万人死于肺结核。许多非结核分枝杆菌（NTM）也已被确定为致病病原体，对免疫功能低下人群感染威胁越来越大。分枝杆菌的鉴定可以通过MALDI-TOF MS方法进行改进，因为与传统方法相比，MALDI-TOF MS方法提高了细菌鉴定的速度和准确性，成本更低。考虑分枝杆菌的缓慢生长时间，依赖于种群的传统的生化鉴定，从细菌菌落完全形成后进行生化反应，通常需要7-21天的时间。相反，MALDI-TOF MS技术在细菌形成的菌落适合于样本制备后可以数小时内可以得到相同的结果. 布鲁克 MALDI Biotyper公司(MBT, BrukerDaltoniksGmbH;Billerica,MA,美国）和Vitek MS（美国北卡罗来纳州bioMerieux公司）都有拥有自主分枝杆菌鉴定程序。分枝杆菌的失活是样品处理的关键点之一。布鲁克采用95加热块热灭活30分钟, 而生物梅里埃则应用与放在70%酒精中的硅珠3000转/分涡流混合(Vortex Genie 2[scientific industry] with MoBio Vortex Adaptor）10-15分钟。细菌颗粒与加在纯乙腈中的硅珠漩涡混匀1分钟或在70%乙醇中的硅珠漩涡混匀10-15分钟。通过旋涡混匀机械破碎后，样品按顺序用等量的70%甲酸和纯乙腈处理，在MALDI 靶板上滴加1微升提取物，干燥并用1 微升a-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）基质覆盖。
2.2.4、丝状真菌
对于丝状真菌，文献报道了几种不同的培养条件和提取方法。 布鲁克 MALDI Biotyper流程建议沙伯劳液体肉汤应该边振摇边培养。实验室也广泛采用沙伯劳庆大霉素-氯霉素琼脂平板进行真菌培养，这种情况下，通常在27摄氏度下培养72小时。收集部分真菌菌丝体并用改良的甲酸提取方法进行蛋白抽提。在1.5毫升试管中，将300微升纯水和900微升纯乙醇与真菌样本中充分混合。13000Xg离心10分钟，去上清液，风干1小时。将干燥的样品在20-50微升70%甲酸溶液中孵育5分钟。然后加入等量的纯乙腈孵育10分钟后，将样本滴加到MALDI靶板上进行分析。
