核磁共振波谱法在食品分析中的应用
一、概述
核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）波谱是一种基于特定原子核在外磁场中吸收了与其裂分能级间能量差相对应的射频场能量而产生共振现象的分析方法。核磁共振波谱通过化学位移值、谱峰多重性、偶合常数值、谱峰相对强度和在各种二维谱及多维谱中呈现的相关峰，提供分子中原子的连接方式、空间的相对取向等定性的结构信息。
在一个分子中，各个质子的化学环境有所不同，或多或少受到周边原子或原子团的屏蔽效应影响，因此它们的共振频率也不同，从而导致在核磁共振波谱上各个质子的吸收峰出现在不同的位置上。但这种差异并不大，难以精确测量其绝对值，因此采用一个信号的位置与另一参照物信号的偏离程度表示，称为化学位移（Chemical Shift），即：某一物质吸收峰的频率与标准质子吸收峰频率之间的差异，是一个无量纲的相对值，常用符号“δ”表示，单位为PPm。也可用氛代溶剂中残留的质子信号作为化学位移参考值。在实际应用中，常用四甲基硅烷（TMS）作为参照物。
δ=(Vsample—VTMS)/VTMS×106
核磁共振定量分析以结构分析为基础，在进行定量分析之前，首先对化合物的分子结构进行鉴定，再利用分子特定基团的质子数与相应谱峰的峰面积之间的关系进行定量测定。核磁共振波谱是一专属性较好但灵敏度较低的分析技术。低灵敏度的主要原因是基态和激发态的能量差非常小，通常每十万个粒子中两个能级间只差几个粒子（当外磁场强度约为ZT时）。磁性原子核，如1H和13C在恒定磁场中，只和特定频率的射频场作用。共振频率、原子核吸收的能量以及信号强度与磁场强度成正比。例如，在场强为21特斯拉（T）的磁场中，质子的共振频率为900MHz。尽管其他磁性核在此场强下拥有不同的共振频率，但人们通常把21特斯拉和900MHz频率进行直接对应。以1H核为研究对象所获得的谱图称为氢核磁共振波谱图；以13C核为研究对象所获得的谱图称为碳核磁共振波谱图。
核磁共振谱可提供四个重要参数：化学位移值、谱峰多重性、偶合常数值和谱峰相对强度。核磁共振信号的另一个特征是它的强度。在合适的实验条件下，谱峰面积或强度正比于引起此信号的质子数，因此可用于测定同一样品中不同质子或其他核的相对比例，以及在加入内标后进行核磁共振定量分析。
二、核磁共振谱仪
常见的有两类核磁共振波谱仪：经典的连续波（CW）波谱仪和现代的脉冲傅里叶变换（PFT）波谱仪，绝大多数为后者。组成主要包含超导磁体、射频脉冲发射系统、核磁信号接收系统和用于数据采集、储存、处理以及谱仪控制的计算机系统。
三、定性和定量分析
1.定性分析
核磁共振波谱是一个非常有用的结构解析工具，化学位移提供原子核环境信息，谱峰多重性提供相邻基团情况以及立体化学信息，偶合常数值大小可用于确定基团的取代情况，谱峰强度（或积分面积）可确定基团中质子的个数等。一些特定技术，如双共振实验、化学交换、使用位移试剂、各种二维谱等，可用于简化复杂图谱、确定特征基团以及确定偶合关系等。
对于结构简单的样品可直接通过氢谱的化学位移值、偶合情况（偶合裂分的峰数及偶合常数）及每组信号的质子数确定，或通过与文献值（图谱）比较确定样品的结构以及是否存在杂质等。与文献值（图谱）比较时，需要溶剂种类、样品浓度、化学位移参照物、测定温度等实验条件的影响。对于结构复杂或结构未知的样品，通常需要结合其他分析手段，如质谱等确定其结构。
2.定量分析
与其他核相比，1H核磁共振波谱更适用于定量分析。在合适的实验条件下，两个信号的积分面积（或强度）正比于产生这些信号的质子数：
A1/A2=N1/N2
式中：A1、A2—相应信号的积分面积（或强度）；
N1、N2—相应信号的总质子数。
如果两个信号来源于同一分子中不同的官能团，上式可简化为
A1/A2=n1/n2
式中：n1、n2—相应官能团中的质子数。
如果两个信号来源于不同的化合物，则
A1/A2=n1m1/n2m2=(n1W1/M1)/(n2W2/M2)
式中：ml、m2—化合物1和化合物2的分子个数；
W1、W2—其质量；
M1、M2—其分子量。
由后两式可知，核磁共振波谱定量分析可采用绝对定量和相对定量两种模式。
在绝对定量模式下，将已精密称定重量的样品和内标混合配制溶液，测定，通过比较样品特征峰的面积与内标峰的面积计算样品的含量（纯度）。内标应满足如下要求：有合适的特征参考峰，最好是适宜宽度的单峰；内标物的特征参考峰与样品峰分离；能溶于分析溶剂中；其质子是等权重的；内标物的分子量与特征参考峰质子数之比合理；不与待测样品相互作用等。常用的内标物有：1,2,4,5一四氯苯、1,4一二硝基苯、对苯二酚、对苯二酸、苯甲酸苄酯、顺丁烯二酸等。内标的选择依据样品性质而定。
相对定量模式主要用于测定样品中杂质的相对含量（或混合物中各成分相对含量），由上式计算。
供试品溶液制备：分别取供试品和内标物适量，精密称定，置同一具塞玻璃离心管中，精密加入溶剂适量，振摇使完全溶解，加化学位移参照物适量，振摇使溶解，摇匀。
测定方法：将适量供试品溶液转移至核磁管中，正确设置仪器参数，调整核磁管转速使旋转边峰不干扰待测信号，记录图谱。用积分法分别测定各品种项下规定的特征峰面积及内标峰面积，重复测定不少于5次，取平均值，由下式计算供试品的量Ws:
Ws＝Wr×(As/Ar)×（Es/Er)
式中：Wr—内标物的重量；
As和Ar—供试品特征峰和内标峰的平均峰面积；
Es和Er—供试品和内标物的质子当量重量（质量）（以分子量除以特征峰的质子数计算得到）。
由下式计算供试品中各组分的摩尔百分比：
(A1/n1）／［(A1/n1）＋(A2/n2）］×100
式中：A1、A2—各品种项下所规定的各特征基团共振峰的平均峰面积；
n1、n2—各特征基团的质子数。
4.核磁共振波谱法在食品分析中的应用
NMR技术可以分析食品中水分含量、分布和存在状态的差异及对食品品质、加工特性和稳定性的影响；是取代油脂质量控制实验室中采用固体脂肪指数(SFI）分析方法唯一可行的、有潜在用途的仪器分析方法，并且已经形成了国际标准；可用于研究食品玻璃态转变；可解析碳水化合物的结构，包括糖残基数目、组成单糖种类、端基构型、糖基连接方式和序列以及取代基团的连接位置；研究淀粉的颗粒结构、糊化凝沉的特性和动力学、分子迁移、变性淀粉取代度测定等；NMR是能够在原子分辨率下测定溶液中生物大分子三维结构的唯一方法，在研究蛋白质和氨基酸的结构、动力学以及蛋白质相互作用等方面发挥着重要作用，利用核磁谱研究蛋白质，已经成为结构生物学领域的一项重要技术手段。依据不同食品的特定参考标准，在食品品质鉴定方面也得到有效应用，包括鉴别果蔬和谷物在生长过程中及采摘后的内部品质、成熟度、内部缺陷等，以及肉类、酒类、油脂类食品的原产地和品质优劣等。
