双水相萃取分离免疫球蛋白和单克隆抗体研究
抗体广泛用于疾病治疗、医疗诊断和免疫分离,具有广阔的市场需求和发展前景。抗体主要从动物血液、腹水和细胞培养液中分离得到,尤其是动物细胞培养制备单克隆抗体,已实现规模化生产。然而,目前抗体分离过程的成本仍旧较高,成为抗体产业发展的一个瓶颈,开发经济高效的抗体分离新方法,具有重要意义。双水相萃取具有生物相容性好、分离条件温和、成本相对较低、易于放大等优点,本文针对含人血清白蛋白(HSA)料液中分离免疫球蛋白G (IgG)和细胞培养液中分离单克隆抗体两类典型的抗体分离过程,探讨双水相萃取分离抗体的可行性。主要内容如下： (1)从含有HSA的混合蛋白中双水相萃取分离IgG。比较分析了不同类型双水相系统中IgG的分配情况,选择聚乙二醇(PEG)/羟丙基淀粉(HPS)为合适的双水相系统。考察了PEG浓度、HPS浓度、NaCl浓度和pH对IgG和HSA在PEG/HPS系统中分配的影响,以IgG上相收率(Ytop)和纯化因子(PF)为响应值,利用响应面法评价了四个因素的显著性,并优化了萃取条件,确定最佳分离条件是12%PEG、18%HPS、10%NaCl和pH8.0, Ytop为99.2%,PF为5.28。进一步考察了PEG/磷酸盐双水相系统反萃取IgG,确定反萃取最适条件为磷酸盐(pH7)浓度10%,第一步萃取的上相量与磷酸盐母液(40%,w/w)的质量比为1.6：1。经萃取和反萃取两步分离,IgG收率为84.0%,纯化因子为5.73,实现了从含HSA料液中高效分离IgG。 (2)探讨了NaCl对IgG在双水相系统中分配和溶解性影响的作用机制。首先考察了NaCl对kG分配的影响机制,发现添加NaCl造成PEG/HPS双水相系统相图的双节点曲线向偏离坐标原点方向移动,两相间的疏水差异性增大；利用荧光法测定了NaCl对IgG疏水性的影响,发现随着NaCl浓度增大,IgG分子疏水性增大,这正是IgG选择性分配至上相的主要原因。其次考察了添加NaCl对IgG溶解性的影响,发现添加NaCl加剧了IgG在(NH4)2SO4溶液中沉淀析出,却增大了IgG在PEG溶液中的溶解性,解释了PEG/(NH4)2SO4和PEG/HPS双水相系统中IgG收率的差异。进一步采用等温滴定量热法分析了NaCl对IgG-PEG间相互作用的影响,发现随NaCl浓度增大,IgG-PEG间的相互作用方式发生了改变,高NaCl浓度下IgG-PEG间疏水相互作用增强,明确了添加NaCl增大IgG在PEG溶液中溶解性的内在原因,并提出了NaCl影响的可能机制。 (3)采用两步双水相萃取法从中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养液中分离单克隆抗体MAB。考察了PEG/HPS双水相系统萃取分离MAB,优化了NaCl添加量、pH和料液添加量,确定了最佳条件为12%PEG、18%HPS、15%NaCl、pH6.0和6%CHO细胞培养液,MAB收率和纯度达96.7%和96.0%。采用PEG/磷酸盐双水相系统实现反萃取,得到合适的分离条件为系统中磷酸盐浓度为8%,第一步萃取的上相量与磷酸盐母液的质量比为2.5：1。经两步萃取,MAB收率和纯度分别为86.8±1.0%和97.6±0.5%。比较了双水相萃取和Protein A亲和层析,发现二者得到的MAB纯度相近,表明双水相萃取可作为Protein A亲和层析的潜在替代方法,用于从细胞培养液中高效分离单克隆抗体。 (4)探讨了混合模式配基双水相系统分离抗体的可行性。首先实现了PEG分子与配基的高效偶联,制备了系列配基-PEG。采用环氧氯丙烷法活化PEG,环氧基接入量可达到460μmol·g-1PEG;再将活化PEG与配基偶联,配基接入率达到90%以上。考察了混合模式配基对IgG在双水相系统中分配的影响,包括疏水型配基(MMI-PEG)和荷电配基(MBA-PEG、AHNSA-PEG、MBIA-PEG和MBIS-PEG)。比较分析后发现巯基咪唑苯甲酸(MBIA)较合适,当pH5.0时,添加MBIA-PEG可使IgG富集于上相而大部分HSA分配在下相中。结果表明,混合模式配基双水相系统分离IgG具有一定可行性,相关系统研究还需进一步开展。 综上所述,本文探讨了双水相萃取分离IgG和单克隆抗体,为了提高分离效率,采取了两个策略：(1)添加中性盐,在聚合物／聚合物双水相系统中添加NaCl,通过影响相平衡和抗体疏水特性,促进抗体从下相转移分配入上相；(2)引入混合模式配基,PEG分子与功能配基偶联,通过配基与抗体发生相互作用,吸引抗体进入上相,实现与杂蛋白分离。本文证实了两种方法的有效性,并分析了相关机制,为抗体分离新方法的开发提供了新思路。
