离子液体双水相萃取分离生物活性物质及其机理的研究
双水相萃取技术是提取和纯化生物活性物质的一种新型分离方法，其操作条件温和、易于放大、且可连续操作。离子液体双水相是基于高聚物双水相发展而来的一种高效温和萃取分离体系。与传统的双水相萃取技术不同，离子液体双水相技术采用亲水性的离子液体（ILs）与无机盐的水溶液进行混合，在水中以较高的浓度溶解后形成互不相溶的两相。它有效地将离子液体与双水相萃取技术的优点相结合，不仅具有无毒、安全、简便、快速的特点，而且溶液酸度和溶解度可调、不易乳化、界面更为清晰等。此外，该技术还具有在萃取过程中保持生物物质的活性和构象的优势。几年来，离子液体双水相越来越受到人们的关注。 本研究分别以小分子物质中药罗布麻中的金丝桃苷和异槲皮苷和大分子物质蛋白质为研究对象，将离子液体双水相技术应用于生物活性物质的萃取分离并对其萃取机理展开了研究，以期为生物活性物质的预处理工作提供理论依据。具体内容如下： 1、离子液体微波辅助萃取结合双水相提取中药中的金丝桃苷和异槲皮苷 将离子液体微波辅助萃取与双水相技术相结合萃取富集中药罗布麻中的金丝桃苷和异槲皮苷，并对其机理进行了研究。通过单因素实验和正交实验对金丝桃苷和异槲皮苷提取富集工艺进行了优化，得到最佳萃取富集条件为：0.2g/mL的[bmim][BF_4]溶液作为萃取溶液，在固液比0.02g/mL，萃取温度60oC条件下，对中药罗布麻萃取10min。提取液加入盐NaH_2PO_4后中药罗布麻的提取液将被富集到上相中。使用反相高效液相色谱法检测金丝桃苷和异槲皮苷的含量。使用这种方法萃取富集中药罗布麻的提取液，金丝桃苷和异槲皮苷具有更高的检测限，分别为3.82g/L和3.00g/L，以及较高的提取效率，分别为64%和62%。方法学考察的结果表明：仪器精密度良好，RSD分别为0.75%和0.59%；方法重现性良好，RSD分别为3.2%和2.9%；稳定性很高，RSD分别为0.49%和0.96%。萃取机理研究结果表明：ILs MAE的提取率主要取决于微波过程中对样品微结构的破坏，过长的萃取时间并不利于金丝桃苷和异槲皮苷萃取率的提高。 2、离子液体双水相萃取分离蛋白质 建立了一种离子液体双水相萃取紫外光谱分析并定量检测蛋白质的方法。本研究分别在277nm、404nm和280nm的检测波长对牛血清白蛋白、牛血红蛋白和溶菌酶进行紫外检测。咪唑类离子液体的萃取效果优于胍类和吗啉类离子液体，并且咪唑类离子液体的烷基链越长越有利于蛋白质的萃取。选用3.0mmol[omim][Br]，55%K_2HPO_4盐溶液，10mg/mL的样品加入量，在最佳pH值处升温至45oC，提取10min可得到最佳的萃取效率。双水相提取后牛血清白蛋白、牛血红蛋白和溶菌酶的回收率分别为96.90%（RSD=2.8%）、97.83%（RSD=2.9%）和97.14%（RSD=2.4%）。所拟方法回收率、重现性均较好，且适用于牛血清白蛋白和牛血红蛋白混合样品的检测，为蛋白质分离提取提供了一种新思路。 3、离子液体双水相萃取分离蛋白质的机理研究 为了进一步对提取蛋白质的机理进行研究，首先使用了紫外光谱分析牛血清白蛋白、牛血红蛋白、溶菌酶和胰蛋白酶萃取前后的结构，发现双水相的萃取后蛋白质的结构并未发生显著变化。使用胰蛋白酶考察萃取温度和保存温度对活性的影响。离子液体双水相在大于45oC的条件下保存2h，温度越高，双水相体系上相萃取液颜色越深，蛋白质的结构将发生变化。离子液体双水相体系[omim][Br]/K_2HPO_4采用常温萃取后保存的方法更利于胰蛋白酶发挥作用。之后测定[omim][Br]水溶液的电导率，确定了[omim][Br]/K_2HPO_4的临近簇集浓度（CAC）约为0.07g/mL。使用动态光散射仪和透射电镜对比双水相萃取前后富离子液体相中的簇集现象。研究表明：在双水相体系中加入牛血清白蛋白，形成了粒径在300600nm的簇集体。这种簇集体的动态光散射强度大于离子液体聚集体，从而说明蛋白质能与离子液体形成新的簇集体，有利于萃取分离。
