微阵列—比较基因组杂交技术检测染色体异常
【摘要】近年微阵列一比较基因组杂交(microarraycomparativegenomichybirdization，microarray．CGH)技术被应用到临床细胞遗传学领域。该技术是选择DNA特殊片段作为靶，固化在载体上，形成密集、有序的分子微阵列。然后，从测试标本中提取DNA，将测试DNA和参考DNA用不同的荧光色素标记，杂交到微阵列上，通过检测这两种荧光色素的比率，了解待测标本基因拷贝数的变化。其能够检测染色体亚微结构异常。微阵列技术已成为一个重要的工具，用于产前、产后和植人前诊断染色体亚微结构异常。
在过去30年中，染色体核型分析是诊断染色体病的标准方法。近年来，微阵列一比较基因组杂交(microarraycomparativegenomichybridization，microarray—CGH)技术用于染色体病研究中．该技术又称为“分子核型分析”。可对染色体亚微结构异常进行诊断．本文主要介绍microarray—CGH技术在细胞遗传学方面的应用。microarray—CGH技术简介
一、技术原理与发展
microarray—CGH技术是近年发展起来的一种分子细胞学技术，虽然与传统的比较基因组杂交(CGH)技术基于相同的原理，但传统的CGH是选择中期分裂相作为靶．而microarray．CGH是选择DNA特殊片段作为靶，固化在载体上，形成密集、有序的分子微阵列。因为DNA的特殊片段作靶，可以根据DNA片段大小及密度决定解析度。microarray—CGH可检测到那些不能为传统方法检测到的微重复和缺失。为与传统的核型分析相比较，这种全染色体组阵列检测称为“分子核型分析”。最初．microarray—CGH引入肿瘤细胞遗传学研究领域，是因为肿瘤细胞培养困难，所获得中期分裂相形态欠佳．而且肿瘤细胞染色体改变复杂，用
传统染色体分析方法很难监测到遗传物质微小缺失和重复。应用全基因组的microarray—CGH研究大量的肿瘤标本，可以绘出常发生基因拷贝数改变的区域。而用高密度的microarray—CGH能对这些区域基因拷贝数改变进行详细的分析[。依照基因拷贝数变化的类型和数目可对肿瘤进行分型，鉴别引起肿瘤发生发展的基因[。而最近该技术已用于临
床细胞遗传学，检测有临床表现的染色体微缺失和微重复综合征Es-9]。
二、技术特点
与传统的核型相比，分子核型显示很多的优越性。但microarray—CGH并不能代替传统的染色体分析，因为，其不能检测染色体的平衡易位及多倍体。microarray—CGH是通过检测患者和对照组的基因拷贝数的变化来发现异常的。在平衡易位没有基因拷贝数的变化，因此，不能检测平衡易位。另外，microarray—CGH是通过检测荧光强度的比率来鉴别异常，而来自三倍体的双倍染料的荧光强度最终认为是正常的，所以也不能检测多倍体。
近年来．microarray—CGH开始用于临床细胞遗传学的研究，现将研究结果从3个方面进行综述。检测流产绒毛染色体目前，临床上用绒毛组织制备染色体诊断流产胚胎是否有染色体异常。通常绒毛细胞培养方面存在一些问题。包括：高发培养失败，母亲细胞过度生长，染色体形态不佳等。因此，尽管胎儿染色体有异常。有时也难以发现。Schaeffer等2004年首次发表用microarray-CGH技术检查流产胚胎的染色体。在这项研究中，选择的DNA．array包括每条染色体的末端端粒，所有微小缺失综合征DNA特殊片段。还另外选择一些特
殊位点DNA片段。分析41个流产胚胎，microarray—CGH不仅检测到染色体G带分析发现的所有异常，而且还查到4例染色体亚微结构异常。随后Shimokawa等m]也发表类似的报道，在20例常规染色体分析显示正常核型的流产绒毛标本中，用microarray—CGH分析发现其中1例有3号染色体短臂微缺失。Benkhalifa等和Fritz等[]的研究显示，microarray—CGH具有检测在培养中未增殖细胞的染色体异常的能力。因此。其可检测到常规染色体分析不能发现的染色体异常。
microarray—CGH不仅能检测染色体亚微结构异常，由于其使用标本中提取的DNA进行检测．microarray—CGH还能解决绒毛细胞培养失败所引起的问题。如果将microarray．CGH应用到流产胚胎的染色体的检查中，将能更快、更精确地得到诊断结果。检测多发畸形儿。智力低下儿染色体异常近年来，microarray—CGH技术也应用到多发畸形儿，智力低下儿病因学调查中。LeCaignec等用商业化array试剂盒(包括所有染色体的末端，主要的染色体微缺失综合征及201个覆盖全染色体组的区域)检测49例有3个以上畸形但染色体核型正常的患儿，发现8个亚微结构的异常，包括末端和内部的缺失。亚微结构重复以及复杂的基因不平衡。4例基因型和表型之间有明显的联系。6q末端微缺失在1例母亲和其2个多发畸形婴儿中都监测到，这使得基因型和表型之间的关系不清。另外，3例监测到10q的微重复．这可能是一种遗传多态。其结果显示，microarray—CGH除能检测到染色体的亚显微结构异常外．还能发现一些基因的遗传多态。
Schoumans等[]用microarray．CGH检测一组不明原因智力低下患儿。这4l例患儿都有不明原因的智力低下和多发畸形，常规染色体检查未发现异常。30例曾进行多末端位点的原位荧光杂交(lfuorescentinsituhybridsation，FISH)筛查，11例曾进行光谱核型分析(spectralkaryotyping，Sky)均未发现异常。应用商业化的试剂盒(2600BAC的克隆，以1Mb的间距分散在整个染色体组)对这4l例患儿进行检测。发现4例有染色体亚显微结构异常，该异常的基因片段长度范围在1～14Mb之间。Nowakowska等[]进一步证实microarray—CGH
技术在监测染色体亚微结构异常方面的作用。用染色体微阵列分析(chromosomalmicroarrayanalysis．CMA)技术对9l例智力低下但染色体核型正常患儿进行分析，发现19例(20．8％)患儿有基因拷贝数变化，其中11例(11．8％)基因拷贝数变化与临床表现有关，认为6例(6．5％)是遗传多态。2例(2．1％)基因拷贝数的变化意义不明，异常基因片段长度在0．5～12．9Mb之间。最近，Tsuchiya等用microarray—CGH技术对
4例带有额外标记小染色体的患者进行研究发现．额外小染色体的结构比预想的结构要复杂得多，其他分子细胞遗传学方法无法对其进行详细解析。microarray．CGH技术在细胞遗传学领域的应用将有助于对额外小染色体的解析及更进一步了解其与表型的关系。
在产前诊断中的应用
染色体核型分析应用于产前诊断有三十多年的历史，一直认为是标准的产前诊断方法。虽然核型分析法可准确地鉴别非整倍体和大的染色体结构异常，但这种技术在解析度方面有明显的限制。另一个缺点是由于羊水中活细胞很少，在核型分析前，必须进行1～2周细胞培养。患者等待结果时间长。高危妊娠需要一种快速的检测方法。而microarray．CGH技术能克服这些缺点。如果microarray—CGH能够用于未培养的细胞．可大大缩短患者等待结果的时间。为此目标，Larrabee等用从羊水中提取的游离DNA进行microarray—CGH分析。研究中首先调查11例男性胎儿羊水中游离DNA，与女性胎儿DNA相比较，在SRY基因有明显增强的阳性信号和减少的x染色体特殊位点信号。然后又调查3例21一三体的胎儿，与二倍体比较，在21一三体特殊位点信号明显增加；另外还调查1例x单体的胎儿，在大多数x染色体的特殊位点信号明显减少。结果显示，从羊水中抽取游离的DNA，用microarray—CGH分析，能正确诊断胎儿的性别和染色体数目异常。而且这种技术将有可能成为对胎儿全染色体组进行筛查的方法。
microarray—CGH在监测染色体亚微结构异常的同时，也能检测到遗传多态，因此，将其应用到产前诊断中应慎重考虑其解析度和构成。如果用解析度很高的array．可能检测到一些与临床表现无关的基因拷贝数变化。选择1种低密度的array，覆盖全基因组，平均解析度是10Mb，但在一些区域增加密度，以便检测微小缺失和微小重复综合征和亚末端的缺失。Rickman]用这种方法调查30份产前和产后的标本，除了1例三倍体以外，检测到这组标
本中曾被核型分析及FISH法检测的所有异常。另外，与1Mb的array相比较，证实检测率有改进。最近．Shaffer等[加]用microarray．CGH技术在151份产前标本中检测到1．3％的患儿有染色体异常：而在1375例新生儿中11．4％的患儿有染色体异常。认为造成检测比率的差异是由于40％的新生儿是因为有畸形才进行microaray—CGH检测的。而超声及产前筛查不能发现这些异常。如果将microaray—CGH应用到产前筛查，那么。在产前诊断
中就会发现更多的异常胎儿。
microaray—CGH技术的特点，使一些染色体亚微结构异常儿在宫内得到诊断。同时，用DNA进行检测不需要细胞培养，可快速得到诊断结果。因此该技术在未来的产前诊断领域中有广泛的应用前景。
发展前景
microarray．CGH技术特点使其能检测染色体的亚微结构异常．而且，有可能实现快速和自动检测标本。在细胞遗传学领域将起到重要的作用。使目前条件下无法检测的由于染色体亚微结构异常造成的疾病得到诊断。同时，可大大减少检验花费的时间和人力。在很大程度上将代替染色体核型分析法。由于不能检测染色体的平衡易位和多倍体，因此．传统的染色体检查法也将继续保留在染色体病的诊断中。
