使用一抗的直接 ELISA 实验方案
实验概要
本实验提供了一个使用一抗的直接 ELISA 实验方案。
主要试剂
1. 碳酸氢盐/碳酸盐包被缓冲液 (100 mM)
应将抗原或抗体在包被缓冲液中稀释，从而将它们固定到孔上：
3.03 g Na2CO3
6.0 g NaHCO3
1000 ml 蒸馏水
pH 9.6
2. PBS:
1.16 g Na2HPO4
0.1 g KCl
0.1 g K3PO4
4.0 g NaCl (500 ml 蒸馏水) pH 7.4
3. 封闭液：
常用的封闭剂为溶于 PBS 的 1% BSA、血清、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶。
4. 洗涤液：
通常为 PBS 或含洗涤剂例如 0.05% (v/v) Tween20 的 Tris 缓冲生理盐水 (pH 7.4) (TBST)。
5. 抗体稀释缓冲液：
应在 1x 封闭液中稀释一抗和二抗，以降低非特异性结合。
实验步骤
1. 将抗原包被到微孔板
1) 将抗原在 PBS 或其它碳酸盐缓冲液中稀释至 20 μg/ml 的最终浓度。移取 50 μl 抗原稀释液到 PVC 微量滴定板的第一排微孔中，使该微量滴定板的微孔上包被抗原。按需要在微量滴定板上进行梯度稀释。
通常将含纯抗原的试样以低于 2 μg/ml 的浓度加到微量滴定板上。纯溶液不是必需的，但是原则上，试样中超过 3% 的蛋白质应为靶蛋白（抗原）。抗原蛋白质浓度不应超过 20 μg/ml，因为这将使微量滴定板上的大部分可用位点饱和。 |
2)
确保样品所含抗原的浓度在抗体检测范围内。 |
3) 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育 2 小时，或在 4℃下孵育过夜。包被孵育时间可能需要某些优化。
4) 弃去包被液，并洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入 200 μl PBS。在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去溶液或洗涤液。在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴。
2. 封闭
1) 每孔添加 200μl 封闭缓冲液（5% 脱脂奶粉/PBS），封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。替代封闭剂包括 BlockACE 或 BSA。
2) 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育至少 2 小时，或如更方便的话，则在 4℃下孵育过夜。
3) 用 PBS 洗涤微量滴定板两次。
3. 用抗体孵育
1) 添加 100 μl 抗体，其刚在使用前在封闭缓冲液中稀释成最佳浓度（依照制造商说明书）。
2) 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育 2 小时。此孵育时间可能需要优化。2 小时通常足以获得强信号，但如若获得弱信号，则当在 4℃下孵育过夜时往往会观察到更强的染色。
3) 用 PBS 洗涤微量滴定板四次。
4. 检测
1) 使用多道移液器或多档移液器为每孔分配 100 μl（或 50 μl）底物溶液。
2) 待显色充分后（如有必要），将 100 μl 终止液添加到微孔。
3) 用酶标仪读取每孔的吸光度（光密度）。
注意：某些酶底物被认为是有害的（潜在致癌物），因此始终要小心处理并佩戴手套。
5. 数据分析
由系列稀释液得到的数据绘制标准曲线，浓度标在 X 轴（对数标度）上，而吸光度标在 Y 轴（线性标度）上。通过内插法在此标准曲线上得出样品浓度。
