不同产地铁皮石斛多糖的提取与含量的测定
在《神农本草经》中，石斛被列为上品药材，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳等功效。现代药理研究表明，药用石斛的有效成分主要是生物碱和多糖，具有抗肿瘤、抗衰老、增强人体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等作用。由于石斛用药的扩大，需要大量的石斛原材料投入药品的生产和研制。据全国中药资源调查统计，石斛每年需求量为80万～100万 kg，国内外植物药材市场对石斛的需求量每年约以20%的速度增长，而野生资源的匮乏，今后只能依靠人工栽培来大量满足市场需求。在国外，20世纪30年代就有日本学者对石斛鉴别进行研究，但对石斛药理研究、栽培加工生产大多还是集中在国内。石斛产业发展急需优化种质资源。石斛属植物品种多，由于引种栽培历史较短，目前生产上栽培的石斛品种种质混杂，通过对石斛品种资源收集、保存和鉴别，可为促进人工栽培石斛提供优质的品种资源支持。为此，采集不同产地的石斛，进行多糖含量的测定，为药用石斛品种资源的鉴别、筛选提供依据，具有重要意义。
1 材料与仪器
1.1 材料
石斛采集于全国各产地，经广西药用植物园李力研究员鉴定均为正品，阴干，粉碎后备用。详见表1。
表1 不同产地品种石斛药材
序号产地药材名称1广西西林县铁皮石斛2广西桂平白石山铁皮石斛3浙江温州铁皮石斛4广西容县都峤山铁皮石斛老条5广西上林县绿杆南山铁皮石斛6广西靖西县树上仿野生种植——南山铁皮石斛7广西大新县红杆南山铁皮石斛
1.2 试验仪器及试剂
紫外分光光度计UV-2550：日本SHIMADZU；石油醚（馏程60 ℃～90 ℃，AR）、浓硫酸（98%，AR）、苯酚（AR）等：西陇化工股份有限公司。
2 方法与结果
2.1 供试液的制备
参照文献[1-3]设计，精密称取浙江铁枫石斛药材粉末50.55 g，加入石油醚500 mL回流提取3次，每次2 h，过滤。药渣挥干，加入80%乙醇500 mL回流提取3次，每次2 h，过滤。药渣挥干，加入1 000 mL蒸馏水煎煮3次，每次1 h。过滤得到水提取液，合并浓缩至约200 mL，得水提浓缩溶液（粗多糖提取液），转移至分液漏斗中，采用Sevag法除蛋白，加入50 mL氯仿-正丁醇混合溶液，振摇萃取，分取水层，同法操作数次，直至无乳白色沉淀出现为止。所得水层即为脱去蛋白的多糖溶液，抽滤，向50 mL滤液中加入乙醇至其浓度为80%，静置过夜，抽滤，将所得沉淀用丙酮、乙醚、95%乙醇分别进行洗涤，沉淀自然挥干，得到多糖2.672 2 g，置于干燥器中备用。
2.2 溶液的配制
2.2.1 葡萄糖标准溶液的配制
精密称取葡萄糖对照品0.050 7 g，加蒸馏水溶解，定容于250 mL量瓶中，配成0.202 8 mg/mL葡萄糖标准溶液。
2.2.2 样品溶液的制备
称取药材粉末2 g，精密称定得2.001 1 g，加入石油醚50 mL回流提取3次，每次2 h，过滤。药渣挥干，加入80%乙醇40 mL回流提取3次，每次1 h，过滤。药渣挥干，加入60 mL蒸馏水于90 ℃保温提取2 次，每次1 h，过滤，用热蒸馏水反复洗药渣并与过滤所得水提取液合并，采用Sevag法除蛋白后，定容至250 mL量瓶中，得样品溶液。
2.2.3 测定方法
采用硫酸-苯酚显色法测定，取多糖溶液1 mL，置于10 mL具塞试管中，加入5%苯酚溶液1.0 mL，将试管放入冷水浴中加入5.0 mL浓硫酸，于沸水浴中加热10 min，于冰水浴中冷却至室温，放置20 min，在489 nm下测定吸光度。
2.3 方法学考察
2.3.1 标准曲线的绘制
精密称取8.5 mg的葡萄糖对照品，置于100 mL量瓶中，用蒸馏水稀释定容，得到0.085 mg/mL对照品溶液，吸取1，2，4，6，8和10 mL葡萄糖对照品溶液分别置于10 mL量瓶中，以蒸馏水定容，摇匀，得系列对照品溶液。精密吸取系列对照品溶液各1 mL，置于10 mL具塞试管中，均加入5%苯酚溶液1.0 mL，将试管放入冷水浴中加入5.0 mL浓硫酸，于沸水浴中加热10 min，于冰水浴中冷却至室温，放置20 min，在489 nm下测定吸光度，另精密吸取1 mL蒸馏水，同法操作，作为空白参比。以吸光度（A）为纵坐标，以系列对照品溶液浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线。得线性回归方程A=10.438 9C，相关系数r=0.993 0，线性范围0.017～0.085 mg/mL。
2.3.2 换算因子的测定
取多糖100 mg，共3份，精密称定，置于100 mL量瓶中，加蒸馏水溶解，定容，摇匀，得多糖水溶液，精密吸取10 mL，置于50 mL量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀，备用。精密吸取此液1 mL置于10 mL具塞试管中，按照2.2.3的方法测定吸光度，由标准曲线计算溶液中葡萄糖浓度，按式（1）求出换算因子。
式中：W——称取多糖的质量，mg；C——葡萄糖浓度，mg/mL；D——稀释倍数。
多糖的换算因子计算见表2。由此可得换算因子f=3.879 8，结果见表2。
表2 换算因子测定结果表
序号精制多糖2100.10.5160.0494.110 2 3101.10.5680.0543.744 4质量/mg吸光度A供试液葡萄糖浓度/mg·mL-1换算因子f换算因子平均值1100.30.5550.0533.789 4 3.879 8
2.3.3 精密度试验
精密吸取1 mL样品溶液（广西桂平白石山）置于10 mL具塞试管中，按照2.2.3的方法测定吸光度，重复取样测定5次。精密度RSD计算结果为0.30%。
2.3.4 稳定性试验
精密吸取样品溶液（广西桂平白石山）1 mL置于10 mL具塞试管中，按照2.2.3的方法，在0，20，40，60，80和100 min测定吸光度，考察样品溶液在2 h内的稳定性。测定结果RSD值为1.39%。
2.3.5 重现性试验
取石斛药材（广西桂平白石山）粉末2 g，共5份，精密称定，按照2.2.2的方法制备样品溶液，精密量取样品溶液1 mL置于10 mL具塞试管中，按照“2.2.3”项下方法测定吸光度，计算多糖含量及RSD值，结果多糖含量为4.05%，RSD%为3.76%，重现性良好。
2.3.6 加样回收试验
精密吸取5份已知多糖含量（1.13 mg/mL）的样品溶液（广西桂平白石山）30 mL置于50 mL量瓶中，分别加入葡萄糖对照品溶液10 mL，用蒸馏水定容，摇匀，从中精密吸取1 mL置于10 mL具塞试管中，按照2.2.3的方法测定吸光度，计算回收率及RSD值，结果见表3。
表3 加样回收试验测定结果
编号质量浓度/mg·mL-1回收率/%平均回收率%RSD/% 10.072 0103.5 20.071 9101.1 30.071 796.2 40.072 1106.0 50.072 0103.5 102.13.67
2.4 多糖含量的测定
按照2.2.2的方法制备样品溶液，平行制备3份，各精密吸取1 mL置于10 mL具塞试管中，按照2.2.3的方法测定吸光度，由标准曲线折算样品溶液中葡萄糖浓度，按式（2）计算多糖含量。
式中：C——样品溶液中葡萄糖浓度，mg/mL；D——稀释倍数；f——换算因子；W——样品质量，mg。
测定结果见表4。
表4 不同产地多糖含量的测定结果
序号产地药材名称多糖含量/% 1广西西林县铁皮石斛6.30 2广西桂平白石山铁皮石斛4.15 3浙江温州铁皮石斛6.90 4广西容县都峤山铁皮石斛老条14.95 5广西上林县绿杆南山铁皮石斛4.60 6广西靖西县树上仿野生种植——南山铁皮石斛5.32 7广西大新县红杆南山铁皮石斛8.81
3 讨论
试验以葡萄糖为对照品，采用苯酚-硫酸法，通过紫外分光光度法测定不同产地石斛中多糖含量，对多糖的提取及精制参考了文献[1-3]的提取方法。从7批不同产地石斛中多糖含量测定结果可以看出，产地对药材中多糖的含量有明显影响，其中含量最高的为容县都峤山（14.95%），最低的为广西桂平白石山（4.15%），测量仪器为紫外分光光度计UV-2550，所测得的含量均高于最低检测限。
4 结论
铁皮石斛含有的多糖具有较好的药理作用，试验测定其中多糖的含量，对其质量控制及进一步产品生产具有参考意义，试验所采用方法简单可行、重现性好，建立了石斛多糖含量测定方法，可为石斛药材的品质评价和质量控制提供指导。
参考文献：
[1] 郭志烨, 韩丽, 杨明. 中药多糖定量测定方法的探讨[J]. 中成药, 2014, 36(10): 2172-2176.
[2] 谭敏, 邱细敏. 白术多糖含量两种测定方法的比较[J]. 现代中药研究与实践, 2012, 26(2): 73-75.
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