细胞凋亡的细胞凋亡检测
细胞凋亡在胚胎发育、造血、免疫系统的成熟以及维护正常组织和器官的细胞恒定与生长平衡，乃至机体衰老方面都起着重要作用。因此，有关凋亡的研究在临床和基础等各个领域已经广泛开展,凋亡细胞的检测方法显得非常重要。流式细胞仪( Flow cytometry ,FCM) 将流体喷射技术、激光光学技术、电子技术和计算机技术等集于一体,较其它方法有不可比拟的优越性，既可定性又可定量,且具有简单、快速和敏感性高的特点,可进行多参数和活体细胞分析。在APO 的研究得到较为广泛的应用，开辟了新途径。
1 光散射法
在FCM 系统中，被检细胞在液流中通过仪器测量区时,经激光照射,细胞向空间360°立体角的所有方向散射光线,其中前向散射光( FSC) 的强度与细胞大小有关,而侧向散射光(SSC) 的强度与质膜和细胞内部的折射率有关。细胞凋亡时,细胞固缩,体积变小,核碎裂形成,细胞内颗粒往往增多,故凋亡细胞FSC 降低而SSC 增高。细胞坏死由于胞体肿胀,细胞核亦碎裂分解故FSC 和SCC 均增高。正常细胞FSC 高而SSC 低。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞表面免疫荧光分析结合起来,用以区别辩认经这些特殊处理发生选择凋亡的淋巴细胞亚型,也可用于活细胞分类。值得注意的是,根据FSC 和SSC 判断凋亡细胞的可靠性受被测细胞形态上的均一性和核细胞浆比率影响很大,因此在某些淋巴细胞凋亡中,用光散射特性检测凋亡的可靠性较好而在肿瘤细胞凋亡中其可靠性较差。
2 细胞DNA 含量的测定
细胞凋亡时,核酸内切酶激活,导致DNA 断裂,这是凋亡的特征性表现,也为FCM 鉴别凋亡细胞奠定了基础。而检测细胞凋亡DNA 断裂的方法中,最常用、最简便的就是细胞DNA 含量分析。当细胞用乙醇、TrtionX—100 处理后细胞膜上出现漏洞,小片段DNA 从细胞内释放出来,使其DNA 含量低于正常细胞的二倍体。用碘化丙啶( PI) 染色后分析,可在二倍体C0/ G1 ,峰前出现“亚二倍体”峰,即细胞凋亡峰(APO峰) ,根据APO 峰可测出凋亡细胞百分率,该法简单易行,可大批定量检测凋亡标本,亦可同时分析细胞的细胞周期位置。另外,应用FCM 方法通过对DNA 和RNA 的联合检测可以鉴别出G0 期细胞,因此,可分析细胞凋亡与G1 或G0 细胸的关系。DNA 降解的程度取决于凋亡的阶段、细胞的类型和凋亡诱发因子的特性。染色过程中DNA 的逸出量变化也影响FCM 检测结果。据研究,将高浓度的磷酸盐———枸椽酸盐缓冲液加入漂洗液中,可增高降解DNA 的逸出量,从而提高鉴别凋亡细胞与正常细胞的能力。
DNA 含量测定在检测细胞凋亡中的局限性在于其特异性和敏感性均不高。特异性不高是因为APO 峰代表了一组细胞群体,包括凋亡细胞、机械损伤细胞、低DNA 含量的细胞或不同染色体结构的细胞,在上述情况下,DNA 与荧光染料的结合量均小。另外,非固定的细胞在低渗溶液中被溶解时,可导致大量的核碎片出现,此时APO 峰的细胞数目只代表了核碎片的数目,并不代表凋亡细胞数目。敏感性较差的原因是细胞凋亡早期只有DNA 断裂点出现,但尚未出现DNA 片段的大量丢失,所以该法不能检出早期凋亡细胞和发生于S 期或G2/ M 期的凋亡细胞,因为其实际含量不低于二倍体细胞所含的DNA ,因此该法进行凋亡细胞分析时应结合其它形态或生化方法,以期更准确地分析细胞的凋亡状态。
3 Y 啶橙染色法( Acridine Orange ,AO)
AO 可将细胞或细胞核中的双链DNA 和变性DNA 染成不同颜色的荧光。AO 插入双链DNA 中时,发绿色荧光;AO也可与单链或通过变性而产生的DNA 单链发生作用,这时发出红色荧光,因此,通过FCM 检测不同的荧光,可判断凋亡的发生。在测定被标准化后,绿色和红色荧光强度的量与总DNA 含量成比例,红色荧光与总体细胞(红色加绿色) 荧光的比率表示细胞中变性DNA 的比例,因此,这种方法可用于评价DNA 对原位变性的敏感性。有时候,凋亡细胞DNA 降解不明显,依赖于DNA 降解来检测细胞凋亡的方法如细胞DNA含量测定、DNA 末端标记等就难以检测到细胞凋亡变化。AO法检测凋亡的原理不依赖于DNA 片断的产生,因此其最主要的优点是可应用于寡核小体片段与凋亡不相平衡等情况,但AO 染色法不能有效区分有丝分裂细胞和凋亡细胞。
4 若丹明( Rh123) 染色法
细胞生活状态下,胞膜上的钠- 钾泵、钙泵等的作用,使细胞膜内外维持着不同离子的浓度梯度,包括Na + , K+ ,Cl - ,Ca2 + 等,形成细胞膜电位。FCM 可以检测亲脂性离子荧光染料在胞膜内外的分布,来测量膜电位的高低,以评价细胞的活力。Rh123 是一种亲脂性阳离子荧光染料,对细胞膜具有通透性,线粒体膜尤敏感。细胞存活状态时,若丹明123 通过细胞膜,积聚于线粒体发出绿色荧光。在细胞凋亡时,线粒体膜的转运能力下降,电负性降低,故细胞线粒体积聚Rh123 的能力也丧失,荧光强度降低,据此检测细胞的凋亡变化。但应指出,在凋亡的早期阶段,由于胞膜尚完整,大多数细胞器和细胞功能相对较好,因此,Rh123 法对于早期凋亡细胞和活细胞的鉴别比较困难。
5 原位末端标记技术
细胞凋亡时,DNA 断裂早于形态学改变及DNA 含量减少,原位末端标记( ISEL) 是将渗入到凋亡细胞中的外源性核苷酸在酶和DNA 的催化下与凋亡细胞因内源性核酸酶的激活而产生的单股或双股断裂相结合,较前述方面具更高灵敏性。通常有两种方法: ①DNA 聚合酶I 或klenow 大片段介导的单位缺口平移( INST) ; ②末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记( TUNEL) 。
INST 是利用DNA 多聚酶将核苷酸整合到凋亡细胞内断裂的DNA 处的3’末端,同时水解5’末端,以修复DNA ,若使用已标记的核苷酸即可显示出有断裂DNA 的细胞。1993 年,Gorczyca 等提出了末端脱氧核糖核酸转移酶( TdT) 标记法采检测凋亡细胞的DNA 断裂,此种方法已得到广泛应用。由于内源性核酸内切酶激活,细胞自身的染色质或DNA 被切割,并产生与DNA 断点数目相同的3’2 羟基末端, TdT 可以将生物素化的dUTP 标记至3’2 羟基末端,通过卵白素2FITC 系统,使DNA 的断点部位发生特异荧光而签别出凋亡细胞,TdT 末端标记法是鉴别凋亡细胞比较特异的一种方法。脑组织中的凋亡细胞很少,因此基因组DNA 片断需要更灵敏的检测技术。将TUNEL 法与FCM 结合起来可以提高检测凋亡细胞中DNA 片断的灵敏度。经凋亡诱导因子处理一定时间后的细胞,原位末端标记的凋亡比Hoechst33342 染色显示的要多,提示TUNEL 可检测出尚未出现明显凋亡形态学特征但已发生DNA 裂解的核,从而使检测的灵敏度提高。对比研究表明, TUNEL 的敏感性远远高于ISNT ,尤其在APO早期TUNEL 法阳性率较高,可能是APO 发生时DNA 多数为双链同时断裂,单链少见的原因。后者是依赖DNA 多聚酶介导的修复反应,故ISNT 的阳性率相对较低。TUNEL 还可结合细胞同期的分析,可同时了解凋亡细胞DNA 断裂和细胞周期分布之间的关系,近来已成为鉴别和定量凋亡细胞的最常用方法之一。但由于断裂DNA 的标记过程比较复杂,涉及多种因素,所以末端标记的阴性结果并不一定代表DNA链的完整,应排除方法上的问题,如TdT 酶活力的丧失等诸多影响因素。因此应用TdT 末端标记法鉴别凋亡细胞必须同时设阳性及阴性对照组,以便得到可靠结果。
6 Annexin V/ PI 法
1992 年Fadok 报道在APO 早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserin ,PS) 迁移至细胞外侧,这一现象出现在核染色质变性与核体积缩小之前。AnnexinV 是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白,和磷脂有高亲合力,尤其与带负电荷的磷脂如PS 具极强的结合力,利用其特性可以检测细胞凋亡。但坏死细胞PS 亦暴露于外表使Annexin V 结合阳性,因此使用Annexin V 这一参数不能区分坏死或凋亡,必须同时采用PI 这一参数将坏死细胆区分开来。FCM 通过Annexin V —FITC 标志暴露于细胞膜上的PS 结合PI 进入损伤细胞膜标记降解DNA 分析凋亡与坏死细胞。在检测时有4个亚群包括机械性损伤细胞(Annexin - / P1 + ) 、正常细胞(An2nexin - / PI - ) 、凋亡细胞(Annexin + / PI - ) 和继发性坏死细胞(Annexin + / PI + ) 被区分。Boersma 等应用Ampexin V2FITE染色法检测细胞毒药物处理后的中国仓鼠细胞凋亡变化,FCM 检测发现荧光信号强弱不同的两种细胞亚群。进一步形态学等证实弱荧光细胞亚群代表早期凋亡细胞,强荧光亚群代表晚期凋亡细胞,可见其是检测和定量凋亡细胞的一种较为可靠的方法。细胞凋亡时膜上PS 外露早于DNA 断裂发生,因此该法检测早期凋亡更为灵敏,且该法不需要固定细胞,避免了PI 法因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL 法因固定出现的DNA 片段丢失,因此更加省时,结果亦更可靠,是目前最为理想的凋亡定量检测方法。
7 其 他
7.1 ssDNA 单抗法 把抗单链DNA(ssDNA) 单克隆抗体用于细胞凋亡的检测,是一种偶然发现,因为在应用ssDNA 单抗(荧光法) 检测细胞毒性药物诱导DNA 损伤中,观察到凋亡的白血病细胞(MOL T24) 有较强的荧光,后来经过适当的改进,证明ssDNA 单抗可以特异地识别凋亡细胞。与TUNEL法相比,ssDNA 具有更强的灵敏性。TUNEL 法检测的凋亡细胞可能只是单抗法检测的凋亡细胞中的一个亚类。ssDNA法检测APO 一般用免疫荧光法。但也可和FCM 结合应用。单抗法使用简便、成本低、应用广泛。ssDNA 单抗可以区别坏死和凋亡、甚至能检测前期凋亡,凋亡后坏亡和一些特殊的凋亡形式(如无片段化的细胞凋亡) 。因此, ssDNA 单抗法可望成为一种新的特异灵敏检测细胞凋亡的方法。
7.2 细胞凋亡的相关蛋白分析 研究发现,有不少基因参加凋亡调控,这些基因产物可参与促进或抑制APO 的发生、发展,因此检测凋亡调节基因蛋白对研究APO 及其调控有重要作用。迄今为止,已可对大量细胞凋亡调节基因的蛋白产物分析,如P53 蛋白、caspases、C2myc、Fas 抗原、TNF、bcl22 家族蛋白、cyclin、ras 等。FCM 用荧光标记的各种调控蛋白单抗染色,收集不同波长的荧光信号,检测细胞膜表面或细胞内荧光分子数量,可以了解每个细胞的变化,而且所需样品少,方法简便、快捷、准确。
8 展 望
近几年来,随着FCM 技术的不断发展和APO 研究的逐渐深入,FCM 在细胞凋亡研究中日益广泛。应用FCM 定量检测凋亡细胞简便、快速、客观,并可进行多参数检测,因此,可同时对APO 及其相关的癌基因表达、细胞周期分布等诸多因素进行相关分析,可以比较深入地了解凋亡的调节机制。尽管应用FCM 进行细胞凋亡研究的方法较多,但FCM检测凋亡细胞的方法一般基于细胞凋亡过程中形态、生化等某一方面的特性,因而难于了解凋亡过程中发生的各种变化的相互关系,也使该类方法缺乏特异性,所以,联合应用多种针对不同特性的FCM 检测方法,才能更为有效地鉴别凋亡细胞。同时,FCM 研究结果尚需同时结合形态学观察或生物化学方法,才能更加深入地了解凋亡细胞的生物学特性。随着生物技术的发展及人们对APO 本质认识的深入,相信在不久的将来,定会有更为特异和敏感的方法问世,有助于细胞凋亡取得突破性进展。
