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流式检测细胞凋亡还有哪些方法？

2020.8.25

　　前面讲到利用流式细胞术进行细胞凋亡检测的annexinV/PI双染色法，今天主要简要介绍SYTO/PI双染色法、细胞DNA含量分析法、TUNEL法。

　　SYTO/PI双染色法

　　SYTO系列染料是一种细胞膜通透性的核酸染料，可以自由进入活细胞与细胞内的DNA或者RNA结合，未结合时发射荧光信号的能力很弱，与核酸结合后发射荧光信号的能力大幅度升高。根据SYTO发射荧光信号波长的不同，主要可以分为蓝、绿、橙和红四大类。

　　用SYTO染料标记细胞后，尤其是与PI染料共同标记时可以区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，因此其最主要的应用就是检测细胞凋亡，其中最具有代表性的是SYTO11、SYTO16、SYTO17和SYTO62等。

　　SYTO与活细胞的核酸结合得最多，所以用SYTO标记细胞时，活细胞SYTO发射的荧光信号最强，SYTO与凋亡细胞核酸结合的能力大幅度减弱，与坏死细胞核酸结合的能力最低，所以SYTO染料可以用于鉴别活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。

　　SYTO染料结合凋亡细胞核酸的能力减弱的确切机制目前尚未明确，可能与细胞凋亡时染色质固缩导致SYTO结合位点减少以及RNA降解等有关。

　　SYTO/PI双染色法检测细胞凋亡的方法非常简单，只需将SYTO染料和PI染料直接加入待测的单细胞悬液中，SYTO染料的标记终浓度为50nmol/L,PI染料的标记终浓度为5ug／ml，避光常温静置20min即可。SYTO11和SYTO16由488nm激光激发，FL1通道接收荧光信号；SYTO17和SYTO62由633nm激光激发，APC通道（通常是FL4）接收荧光信号。

　　下图所示的是用SYTO/PI双染色法检测细胞凋亡的流式图。活细胞、凋亡细胞和坏死细胞结合SYTO的能力依次递减，PI是细胞膜非通透性染料，活细胞和凋亡细胞的细胞膜是完整的，不能被PI染料标记，而坏死细胞的细胞膜已经不完整，可以被PI染料标记。所以用SYTO/PI双染色时，活细胞表现为SYTOhighPI-，如图中右侧细胞群所示；凋亡细胞表现为SYTOdimPI-（中间细胞群）；坏死细胞表现为SYTOlowPI+（左侧细胞群）。

　　细胞DNA含量分析法检测细胞凋亡

　　用PI染色法检测细胞内DNA含量也可以用于检测细胞凋亡。细胞凋亡时核酸内切酶被激活，细胞内的DNA广泛断裂，一方面在标记PI时必须先用固定剂固定细胞使细胞膜的通透性增加，让PI染料能够通过细胞膜进入细胞内部与DNA结合，此时凋亡细胞内断裂的DNA小碎片就可以通过细胞膜逸出细胞；另一方面凋亡细胞内的DNA小碎片也会降解。所以，凋亡细胞内的DNA含量比正常细胞少，在PI通道上检测到的荧光信号就会比正常二倍体DNA含量的荧光信号弱。

　　所以凋亡细胞会在DNA直方图二倍体峰的前面出现一个DNA含量少于二倍体的亚二倍体峰（凋亡细胞峰），如下图所示。PI染色法检测细胞内DNA含量的方法后边还会有详细介绍。

　　虽然此法比较简单，也较为常用，但是这种方法的特异性并不是很高。因为亚二倍体峰的出现并不是凋亡细胞所特有的，非整倍体细胞、机械损伤的细胞也可以出现这种亚二倍体峰。所以用此方法检测细胞凋亡时，应先用其他方能确定样品细胞内的确有凋亡细胞，而没有其他引起亚二倍体峰出现的情况，再用此方法定量检测样品内凋亡细胞的比例。

　　TUNEL法

　　TdT介导的dUTP缺口末端标记法（TdTmediated-dUTP nick end labelling, TUNEL）是20世纪90年代发展起来的检测细胞凋亡的方法，可用于石蜡包埋组织切片和冰凉组织切片的免疫组织化学分析和单细胞悬液的流式细胞术分析。细胞凋亡时，核酸内切酶被活化，细胞内双链DNA上会出现很多不对称的断裂点，此时加入脱氧核苷酸末端转移酶（terminaldeoxynucleotidyl transferase, TdT）和荧光素偶联的dUTP,TdT可以催化荧光素偶联的dUTP连接到凋亡细胞DNA上的这些断裂点，而荧光素偶联的dUTP不能连接到活细胞内完整的DNA，流式分析就可以区别凋亡细胞和正常活细胞。

　　TUNEL法检测细胞凋亡时需要将外源性的荧光素偶联的dUTP和TdT导入细胞内，而凋亡细胞和活细胞的细胞膜都是完整的，所以标记时首先要用固定剂固定细胞，然后用打孔剂在细胞上打孔，让荧光素偶联的dUTP和TdT进入细胞内才能完成标记过程。

　　TUNEL法不仅能够识别凋亡细胞中由核酸内切酶催化产生的DNA断点，而且能够识别有丝分裂DNA复制时产生的组成性生理性切口和组蛋白转录后修饰点，以及坏死细胞的随机DNA断点。因此，TUNEL法检测细胞凋亡的特异性并不高，无法区分凋亡细胞、有丝分裂的细胞和坏死细胞。

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