理性改造二醇脱水酶减少1,2,4-丁三醇副产物的积累
2017年2月13日，代谢工程杂志在线发表了题为《Rational Engineering of Diol Dehydratase Enables 1，4-Butanediol Biosynthesis From Xylose》的研究成果，研究通过理性蛋白质工程改造二醇脱水酶（Diol Dehydratase）使得大肠杆菌产1，4-丁二醇（1，4-BDO），减少了1，2，4-丁三醇（1，2，4-BTO）副产物的积累。
在研究工程中，发现1，2，4-丁三醇脱水反应是整个反应链的瓶颈，于是如何减少1，2，4-丁三醇副产物的积累成为该研究的主题。研究者通过人为合成一条反应链较短的代谢通路（图1）。在本研究中，采用外源表达工程化的二醇脱水酶（来源克雷伯氏菌，Klebsiella oxytoca）来催化1，2，4-BTO的脱水反应。
基于之前的报道，来源于克雷伯氏菌的二醇脱水酶以B12为辅酶，它的天然底物为1，2-丙二醇（1，2-propanediol，1，2-PD），在有C3醇-甘油存在的情况下会失活，在这里，研究者利用它来催化非天然的底物C4醇-1，2，4-BTO。通过蛋白质工程改造的常规套路，对催化活性位点的某些氨基酸替换成分子量较小的氨基酸，这样就可以在"诱导契合"反应下使大的底物进入催化活性位点进行催化反应。
上面提到二醇脱水酶的活性会被甘油所抑制，因为甘油属于三醇，1，2，4-BTO也属于三醇，于是提高二醇脱水酶对三醇（底物）的耐受性成为研究的另一个亮点。根据报道，将301位的丝氨酸（S301）突变成丙氨酸(A301)可以提高二醇脱水酶对甘油的耐受性，经过重复研究证明，将S301突变成A301确实可以提高二醇脱水酶对甘油的耐受性，但是对于催化1，2，4-BTO并没有什么帮助。
根据经验，研究将336位的谷氨酰胺（Q336）突变成丙氨酸（A336），增大了催化活性中心的空间体积，使得该酶可以催化1，2，4-BTO，又通过报道和蛋白质工程的操作手段，将300位的缬氨酸（V300）突变成甲硫氨酸（M300），最终形成了具有三个点突变的酶（S301AQ336AV300M），该酶作用1，2，4-BTO的效果要比野生型的高5倍左右。
上面的工作主要是对关键酶-二醇脱水酶进行蛋白质工程的改造，接下来研究者利用前人研究的基础，在大肠杆菌中构建出一条由木糖到1，4-丁二醇的代谢通路，在研究过程中，研究者首先对木糖到1，2，4-BTO的代谢通路做了优化，最后使得1，2，4-BTO的产量可以高达1506mg/ml。在此基础上，导入之前改造的二醇脱水酶，最终使得1.4-BDO的产量可达到209mg/L。
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