测定用乙醇固定的 DNA 的含量
测定DNA含量可以用于:(1)进行基因片段连接实验。(2)进行转化转染之前的质粒浓度测定。
实验方法原理 | DNA和RNA在260nm处有一很高的吸收峰,利用这个原理我们测其OD260,再推算出其浓度。 |
---|---|
实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 一、培养细胞的 DNA 含量的测定 制备单细胞悬液于 200μ l 的 PBS 缓冲液中; 加入 2ml 预冷的 70%乙醇,4℃保存; 1. 取单细胞悬液 1——2×106 个细胞于 PBS(PH=7.2)缓冲液中; 2. 300g 离心 5 分钟,弃上清,反复两次; 3. 重悬细胞于 0.5ml PBS 缓冲液中; 4. 将细胞悬液放置于 2——3ml 冷 70%乙醇中,混匀,保存于4℃,至少30 分钟。 在 4℃条件下可保存 2——3 周。 2、新鲜组织的 DNA 含量的测定 1. 用 200mg 湿重组织用机械法制成单细胞悬液; 2. 500g 离心 5 分钟; 3. 弃上清,重悬于 10ml 染色- 去污剂中; 4. 再过滤,用 200 目的筛网或 70——80μm 的筛网过滤; 5. 上机检测。 3、石蜡包埋组织切片的 DNA 含量的测定 1. 从石蜡包埋切取切片 50 μ m 厚,2——3 片,制成单细胞悬液; 2. 用 PBS 缓冲液洗涤,500g 离心 5 分钟,弃上清; 3. 加入 PI 液 1ml 室温避光 30 分钟; 4. 调整细胞浓度为 1×106/ml; 5. 上机检测。 收起 |
注意事项 | 1. 根据实验的要求,固定剂也可选用 1——3%多聚甲醛; 2. 将乙醇作为固定剂时,乙醇应预冷至 0——4℃; 3. 细胞在固定时,固定剂应缓慢滴入细胞悬液中,使固定剂的浓度缓慢增 加,并不断震摇,以免细胞成团(特别是用乙醇固定时) . |
其他 | 如果想要检测样品的纯度,那么还要再测一次280nm处OD值,计算二者的比率,若比率接近2,说明样品纯度较高。 |