核酸探针标记
实验概要
核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。
实验原理
分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于转基因植物拷贝数的鉴定、临床诊断等方面。双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。
切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响: (a) 产物的比活性取决于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b) DNA酶的用量和E.coli DNA聚合酶Ⅰ的质量会影响产物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。
主要试剂
(1) 10×切口平移缓冲液: 0.5M/L Tris-Cl (pH7.2)； 0.1M/L MgSO4； 10mM/L DTT； 100ug/ml BSA。
(2) 未标记的dNTP原液：除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3种分别溶解于50mM/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,浓度为0.3mM/L。
(3) [α-32P] dCTP或[α-32P]dATP:400 Ci/mM, 10uCi/ul。
(4)E.coli DNA聚合酶Ⅰ：(4单位/ul)：溶于50ug/ml BSA, 1mM/L DTT, 50%甘油，50mM/L Tris·Cl(pH7.5)中。
(5) DNA酶:1mg/ml。
(6) EDTA :200mM/L (pH8.0)。
(7) 10M/L NH4Ac。
实验步骤
(1) 按下列配比混合:
未标记的dNTP 10ul
10×切口平移缓冲液 5ul
待标记的DNA 1ug
[α-32 P]dCTP或dATP(70uCi) 7ul
E.coli DNA聚合酶 4单位
DAN酶 I 1ul
加水至终体积 50ul
(2) 置于15℃水浴60分钟。
(3) 加入5ul EDTA终止反应。
(4) 反应液中加入醋酸铵,使终浓度为0.5M/L, 加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。
注意事项
1、3H，32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记，但通常使用[α-32 P]-dNTP。
2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探针比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。
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