结核杆菌的耐药机制及分子生物学检测方法进展(2
2 目前国内外应用于检测耐药结核杆菌的分子生物学方法
随着分子生物学的发展，尤其是PCR技术的问世，检测耐药可以直接从基因入手，这样与传统的结核杆菌药敏试验相比，不仅大大缩短了检测周期，实现了自动化，而且也降低了生物实验室的危险性。耐药检测包括用PCR扩增基因组内携带的耐药性区域，和进行扩增产物的突变分析。结核分支杆菌耐药性的基因检测技术分为杂交系统和放大系统两大部分。多数放大系统基于杂交系统，其另一部分是PCR 扩增技术。以下主要叙述应用于结核菌耐药性检测中的核酸检测技术。
2．1 PCR/ UHG
Williams等[15]创立在6 h内获得快速检测结核菌利福平耐药性的方法：先用巢式PCR扩增特异的rpoB基因片段，再与根据结核菌rpoB基因Rif区合成的通用异源双链扩增子UHG(universal heteroduplex generator)探针杂交，如果标本中的结核菌rpo B基因有突变，则会产生异源双链，通过电泳可分离异源双链，确定其是否有利福平耐药性。此方法对涂片染色阳性、未经治疗的病例尤为适合。值得注意的是，PCR/ UHG是依据rpo B 基因Rif区的核苷酸变化来确定其耐药性的，少数标本有耐药表现型(用BACTEC检测)，但不能查到其基因型变异，其耐药机制可能是在Rif区外，或不在rpoB基因。
2．2 探针检测LiPA(line probe assay)
Martlila等[16]根据固相反向杂交原则设计的检测方法，将靶DNA用带有生物素的引物进行PCR扩增，带生物素的PCR产物与膜固定的捕获探针杂交，再加入交联碱性磷酸酶的链霉亲和素，洗去未结合的链霉亲和素，加入底物显色，由此来检测靶DNA是否变异。LiPA已由Innogenetics开发成商业试剂盒( INNO2LiPARif . TB)用以检测结核菌利福平耐药性。此方法快速，所需的条件不太复杂，可较多地应用于临床检测。
2．3 错配分析(mismatch analysis)
Nash等[17]用利福平敏感株(H37Ra)和靶DNA一起进行PCR扩增，采用带有T7和SP6 RNA聚合酶启动子的引物。其PCR产物作为模板作RNA转录，转录体杂交后用RNase消化，突变点不能杂交将被切割，琼脂糖电泳可区分未被消化的转录体和断裂产物。错配分析较灵敏，但因涉及RNA操作，一般实验室不容易严格执行无RNA酶实验操作，临床上使用不多见。
2．4 变性梯度凝胶电泳(DGGE)
其原理是双链DNA在递增的变性剂浓度梯度或温度梯度中电泳时，DNA不同区段可根据不同的溶解温度(Tm)而解离。杂交体中碱基的错配会造成相应区段的不稳定，致使同源体和杂交体之间相应区段的Tm差异可达6℃。这样，野生型和突变型单链所形成的杂交体即可被区分出来。值得注意的是，DGGE在分析每一特定的PCR片段之前，需要通过预试验来确定其最佳的电泳条件，以获得最大的分离度。这需要一定的电泳条件，实验室可自行操作。Scarpellini等[18]用DGGE检测临床标本，其基因型被证明是对利福平耐药的结核菌，仅1株对利福平敏感，而在48份脑脊液标本中，其基因型和表现型完全一致。
2．5 单链构象多态性(SSCP)
其原理是在某一条件下，单链(ss)核酸在溶液中会形成一定的二级结构，其碱基的组成会影响二级结构的形成。单个核苷酸的变化也会改变ssDNA的构象，致使其在非变性电泳中泳动的速度发生变化。SSCP广泛用于结核菌耐药性分析，如检测rpoB[19]、katG[20]、rpsL[21]基因等。在检测中要注意以下几个问题：SSCP检测的片段大小在150～200 bp之间，用SSCP 检测较大片段时，所能检出的突变数会减少；要严格控制凝胶及电泳条件；要结合表现型检测结果。随着SSCP的标准化、自动化程度的改善，操作时间也会相应缩短。
2．6 限制性片段长度多态性(RFLP)
因为基因突变，在限制性内切酶酶切DNA片段时，其长度会发生变化，电泳得到其多态性变化。Nachamkin等[22]进行了一系列试验来检测结核菌的耐药性。RFLP用于katG和rslP基因突变的检测，其特异度达100 %，但其敏感度却只有28 %；而检测rpoB基因的异源双链分析达到76 %的敏感度和97 %的特异度。突变可能发生在其他基因，而导致了RFLP检测的低敏感度。在检测耐药性时，要选用合适的方法，并在1份标本中检测所有的耐药基因。
2．7 RT-PCR
临床分离的标本常有多重耐药性，需用多种方法检测，也可根据结核菌的其他性质来确定其是否耐药。Patnaik等[23]用RT-PCR检测分析结核菌的耐药性，采用前体rRNA特异的引物。前体rRNA有一末端茎结构，当成熟rRNA亚单位形成时此结构被切除。RNA合成受抑制将大大影响茎在细菌中的数量。因此，此方法可正确预测结核菌对利福平的耐药性；而异烟肼、乙胺丁醇对此无影响。
2．8 定量PCR
Torres等[24]用定量PCR确定结核菌对异烟肼的耐药性，把细菌放在不同浓度的异烟肼中培养，1～3周后可用定量PCR方法测到耐药株和敏感株间细菌DNA量的微小差异，以此确定菌株是否耐药。定量PCR准确可行，但不易普及。
2．9 分子信标
为一茎环状结构的寡核苷酸探针，其环状区核苷酸序列与靶核酸互补，靠近两端的部分序列互补构成分子信标的茎部，两末端分别标记荧光基团和淬灭基团。当靶核酸存在时，茎部结构结合靶序列而打开，荧光基团和淬灭基团分开，产生荧光，荧光多少与茎部结构同靶序列结合的程度有关。Piatek等[25]用该法检测了75份标本的rpoB基因的突变，方法直观，但需要发光检测仪器，也有可能错过新发生的突变。
2．10 枝链DNA(bDNA)
是一个多重杂交系统，其检测灵敏度大大提高。将靶DNA与固相固定的特异探针杂交，再加入另一特异探针与靶DNA杂交，此探针可结合一树枝状bDNA ，标记有(AP)的探针与bDNA 结合，加入发光底物，用发光检测仪来测量发光强度，灵敏度高，接近PCR水平。已有人将此法用于细菌耐药性检测[26]。
2．11 基因芯片(gene chip) 技术
基因芯片是指将大量不同的生物信息分子（如寡核苷酸、DNA 或cDNA 探针等）以高度密集的方式（通常每平方厘米点阵密度高于400），有序地固定在固相支持物（通常为玻璃）上而形成微阵列。当荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子相结合后，用激光共聚焦荧光扫描或电荷偶联摄像机对荧光信号的强度进行检测，从而对杂交结果进行量化分析，所以可一次性对样本大量序列进行检测和分析。Jing等[27]用cy5标记的引物对靶基因rpoB进行扩增，然后用NDA芯片检测PCR产物，结果其检出率为83%。利用基因芯片探针杂交方法还可以对2个以上不同的耐药性基因同时进行分析，如结核杆菌对异烟肼、利福平、EMB、PZA 等多种药物的耐药基因都可同时进行检测[28]。由于该方法灵敏、方便，特异度高、信息量大，且成本较低，因而具有广阔的临床应用前景。
3 展 望
目前用于结核杆菌耐药性监测的传统方法耗时长不能满足临床治疗的需求，因此，国内外都在寻找1种快速而且灵敏度高的监测方法，以期快速的给临床治疗提供依据。由于结核菌耐药机制复杂，常有多重耐药，其耐药性检测也应选择合适的方法，检测多个耐药基因，并结合传统的培养方法。目前DNA芯片技术发展迅速，可在同一载体上进行多个基因检测，其具有高密度、高容量可导致一个量变到质变的过程，将是非常好的耐药性检测手段。这样可以在1个芯片上检测几种药物的耐药性，即加快了监测速度又节约了成本。随着分子生物学的发展，基因芯片技术的应用前景将会更加广阔，可以及时的为临床治疗提供依据。
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