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分离微管和微管相关蛋白实验

2019.9.18

通过组装/解聚从缺少组装驱动成分的缓冲液中分离微管
在含甘油的缓冲液中通过组装/解聚分离微管
在紫杉醇这种微管稳定剂存在时通过组装的方法分离微管
从用紫杉醇稳定的微管中分离微管相关蛋白
通过ATP释放法从用紫杉醇稳定的微管中分离基于微管的运动蛋白

实验材料	脑组织
试剂、试剂盒	PME 缓冲液
仪器、耗材	匀浆器
实验步骤	1. 收集脑组织（几百克） (1) 如果从屠宰场取脑（猪） ① 只要美国地方检察官允许，在宰杀后尽快收集脑（猪 )。 ② 把脑一个一个地放在薄塑料袋里，立即浸入冰水混合物中，运到实验室。 ③ 在冰库里，研究者带着橡胶手套取出脑、表面的血管、血凝块和脑膜。 ④ 用剪刀把脑剪成小块（1~2 cm），放到冰浴的小烧杯中。 (2) 如果是买的鸡 ① 用锋利的剪刀将鸡断头。 ② 将脑取出放到冰浴的烧杯中。 2. 每克脑加 1 ml PME，在一个 50 ml 用马达驱动（3000 r/min）的匀浆器中用研杵上下各 7 次进行匀浆。这种匀浆器是玻璃筒，Teflon 研杵；每次处理 20~25 g。 PME 缓冲液： 0.1 mol/L PIPES，pH 6.9 2 mmol/L EGTA 1 mmol/L MgSO₄ 1 mmol/L DTT 0.5 mmol/L GTP 3. 匀浆物在 4℃ 以 40000 g 离心 45 分钟。把上清转移到一个新管中，上清里含冰冷的溶解了的微管蛋白二聚体和微管相关蛋白。 4. 上清在 37℃ 温育 30~45 分钟。 5. 在 25℃ 以 40000 g 离心 30 分钟收集组装了的微管。用一个 Dounce 的匀浆器，用步骤 2 中使用的缓冲液以 1/5~1/4 的体积重悬所得到的微管沉淀物，重悬的微管放到一个干净的离心管中。 6. 在冰/水混和物中冰浴 30 分钟。 7. 在 4℃ 以 40000 g 离心 30 分钟使溶液变清。 8. 步骤 7 中得到的微管蛋白通过重复步骤 4 和 5 再做一轮组装。展开