用于 PCR 的模板 DNA 制备实验——冰冻片

2019.3.26

实验步骤	1. 将 10 μl 冰冻切片直接放入含组织裂解液的离心管中。 2. 无菌尖头刀片刮下，放入 300～900 μl 组织裂解液中，并加入 20 mg/ml 蛋白酶 K（PK）10～15 μl，封口膜封口，置 55℃ 3 h 以上。 3. 其间用指轻弹离心管以利裂解。若有沉淀，再加入 5～10 μl 蛋白酶 K，直至无沉淀已澄清为止。 4. 灭活蛋白酶 K 裂解液中含有蛋白酶 K，需放入沸水中 10 min 以灭活蛋白酶 K。 5. 沉淀蛋白质按裂解液量的 1/3 加入蛋白质沉淀液（饱和乙酸钠）并混匀，14500r/mm 离心 15 min。此时，蛋白质沉于管底，DNA 溶解于上清液中。 6. 析出 DNA 取上清液并加入等量冷异丙醇，充分混匀，新鲜标本此时可见 DNA 丝缠绕成团析出。若新鲜标本童太少或固定组织因 DNA 片段较小，无法用肉眼见到 DNA 成团析出，需 14500 r/min 再离心 10 min，一般 DNA 可见于管底。 7. 洗涤溶解 DNA 倒去上清液，加入适量的 75％冷乙醇，以洗掉残存的异丙醇和无机盐等物质，反复洗 2 遍。将管底含有 DNA 的离心管倒扣在清洁纸上，以挥发掉残留的乙醇和水。约 30 min 后，在 DNA 尚不太干时加入适量 TE 溶解 DNA。

实验步骤

1. 将 10 μl 冰冻切片直接放入含组织裂解液的离心管中。

2. 无菌尖头刀片刮下，放入 300～900 μl 组织裂解液中，并加入 20 mg/ml 蛋白酶 K（PK）10～15 μl，封口膜封口，置 55℃ 3 h 以上。

3. 其间用指轻弹离心管以利裂解。若有沉淀，再加入 5～10 μl 蛋白酶 K，直至无沉淀已澄清为止。

4. 灭活蛋白酶 K 裂解液中含有蛋白酶 K，需放入沸水中 10 min 以灭活蛋白酶 K。

5. 沉淀蛋白质按裂解液量的 1/3 加入蛋白质沉淀液（饱和乙酸钠）并混匀，14500r/mm 离心 15 min。此时，蛋白质沉于管底，DNA 溶解于上清液中。

6. 析出 DNA 取上清液并加入等量冷异丙醇，充分混匀，新鲜标本此时可见 DNA 丝缠绕成团析出。若新鲜标本童太少或固定组织因 DNA 片段较小，无法用肉眼见到 DNA 成团析出，需 14500 r/min 再离心 10 min，一般 DNA 可见于管底。

7. 洗涤溶解 DNA 倒去上清液，加入适量的 75％冷乙醇，以洗掉残存的异丙醇和无机盐等物质，反复洗 2 遍。将管底含有 DNA 的离心管倒扣在清洁纸上，以挥发掉残留的乙醇和水。约 30 min 后，在 DNA 尚不太干时加入适量 TE 溶解 DNA。

冰冻片

互联网

喜欢作者我要约稿