免疫荧光操作步骤（漂片，冰冻切片）
实验概要
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
实验步骤
1. 将脑片放到，6 孔板（或 12 孔板），按照二抗说明书，加 3%双氧水封闭 10min（如果是从切片保护液取出，则要用 PBS 洗一遍）；（二抗不同，操作步骤有差别）；
2. 吸去双氧水，PBS 洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；
3. 然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需 50 微升一抗稀释液，小鼠脑片为 30 微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；
4. 然后，4℃，过夜（18h 或者 24h），不建议使用 37℃；
5. 然后，PBS 洗净两遍；剩下步骤见二抗试剂盒说明书。
6. DAB 配方为：10mg DAB 固体加到 20ml 0.01MPBS，临用时加 100-200 微升30%双氧水，注意避光。
7. 显色 10min，看片子染色深浅情况适当调整显色时间。一般 3 分钟显色就比较明显，如果 20 分钟仍未显色，则看下面的参考。
8. 然后 PBS 洗两遍，转移到载玻片，自然晾干。干燥天气 2-3h，潮湿天气 3-4h。
9. 脱水：70%酒精 3min，95%酒精 3min，100%酒精 3min，100%酒精 2min，二甲苯 2min，二甲苯 3-5min。如果片子上盐分较多，在 70%酒精前在双蒸水1min。
10. 将脑片放到 6 空板的山羊血清封闭液中，封闭 20-40min；（如果是从切片保护液取出，则要用 PBS 洗一遍）
11. 吸去山羊血清，PBS 洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；
12. 然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入 PBS 稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需 50 微升一抗稀释液，小鼠脑片为 30 微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；
13. 4℃，过夜（18h 或者 24h），不建议使用 37℃，如果荧光亮度不强，可以延长孵育时间到 48 或 72 小时；
14. 然后，PBS 洗净两——三遍，按照二抗说明书稀释的荧光二抗，室温孵育 2小时。注意避光操作。
15. 0.01M PBS 洗两遍，转移到载玻片上，避光自然晾干；
16. 滴加防淬灭剂后，盖上盖玻片镜下观察。
注意事项
1. 荧光太暗：可能蛋白表达少；可能一抗孵育时间短；二抗孵育时间短；清洗次数过多；溶液 pH 不合适；荧光萃灭；一抗浓度过低或过高；二抗浓度过低或过高；激发波长不在抗体适用波段。
2. 背景荧光太深：一抗浓度过高，清洗不彻底；二抗浓度过高，清洗不彻底；封闭时间过短，非特异性过强；一抗非特异性过强；二抗非特异性过强；显微镜荧光强度过强。
