植物基因组DNA的RFLP
实验概要
本实验介绍了植物基因组DNA的RFLP多态性分析的原理及操作步骤。通过本实验可了解不同植物或同一植物不同个体之间基因组DNA顺序的差异性，掌握DNA限制性酶切片段长度多态性研究的基本方法。
实验原理
DNA多态性是指DNA碱基顺序的差异性。这种差异性不仅存在于不同的植物之间，也存在于同一种植物的不同个体之间。RFLP多态性是指DNA限制性内切酶酶切片段长度的多态性(restniction fragment length olymophorphism)。由于碱基顺序的差异，在不同的种或同一个种的不同个体之间，它们的基因组DNA限制性内切酶位点的种类和数目不同，经特定的限制性内切酶切割后，所产生的限制性酶切片段在大小（长度）和数目方面自然也存在着差异。通过琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭染色，在紫外检测仪下观察，即可直接看到这种差异。电泳分离后，通过Southern杂交也可显示出已知DNA片段的差异。
主要试剂
1. 限制性内切酶
2. 10×限制性内切酶缓冲液
3. 0.5M EDTA(pH 8.0)
4. 溴化乙锭
5. 琼脂糖
主要设备
1. 电泳仪和电泳槽
2. 微量离心管
3. 低温冰箱
4. 37℃水浴锅
实验材料
从不同植物或同一植物不同个体分离出的基因组DNA。
实验步骤
1. 限制性内切酶酶切
1) 将在-20℃冷冻的DNA在冰上融化。
2) 取8支微量离心管按下表所示作好标记，并依次加入所需成分。
品种I | 品种II | 品种I－1 | 品种II－2 | |||||
单酶切 1# | 双酶切 2# | 单酶切 3# | 双酶切 4# | 单酶切 5# | 双酶切 6# | 单酶切 7# | 双酶切 8# | |
DNA | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
10×缓冲液 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
Eco R I | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
Hind III | 1 | 1 | 1 | 1 | ||||
无菌水 | 7 | 6 | 7 | 6 | 7 | 6 | 7 | 6 |
总体积(ul) | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 |
3) 混匀，慢速离心2秒，使溶液全部聚于管底。
4) 37℃保温2－3小时。
5) 加入1／10体积的0.5M EDTA溶液终止反应。
2. 琼脂糖凝胶电泳分析
