peprotech细胞因子注意事项（三）
五、细胞培养和刺激的基本方法
细胞活化的最终结果是产生细胞因子，根据检测指标和标本的不同，研究人员需要选择不同的刺激剂和刺激时间，以获得最佳的实验结果。下表提供了检测一些常用细胞因子的推荐的活化方法。
表1、细胞内细胞因子流式检测推荐的阳性对照活化方法
检测细胞因子 | 阳性对照刺激方法 |
人IFN-g | 方法2 (4-24 小时) |
人TIMP-1 | 方法5 |
人aTNF- | 方法7 (6 小时) |
人IL-1a | 方法3 (6 小时) |
人bIL-1 | 方法3 (24 小时) |
人IL-2 | 方法2 (4-24 小时) |
人IL-4 | 方法4 |
人IL-5 | 方法1 |
人IL-6 | 单核细胞：方法3 (6-12 小时) T细胞：方法6 |
人IL-10 | 方法1 |
人IL-12 | 方法8 |
人IL-15 | 方法3 |
人Fractalkine/CX3CL1 | 方法1 |
人IL-8/CXCL8 | 方法3 (24 小时) |
人MCP-1/CCL2 | 方法3 (24 小时) |
人MIP-1a/CCL3 | 方法3 (24 小时) |
人MIP-1b/CCL4 | 方法3 (24 小时) |
人RANTES/CCL5 | 方法1 |
小鼠IL-2 | 方法9 |
小鼠IL-4 | 方法10 |
小鼠IL-5 | 方法10 |
小鼠IL-6 | 方法11 |
小鼠gIFN | 方法9 or 方法12 |
小鼠aTNF- | 方法9 |
为防止细胞内细胞因子分泌到胞外，在培养的最后4-6个小时，需要使用蛋白转运抑制剂（如3uM monensin，10mg/ml的BFA）
方法1：只使用转染细胞检测
方法2：人的PBMCs使用PMA （10 ng/ml） 和Ionomycin （1 uM） 刺激4-24 小时.
方法3：人的PBMC 使用LPS （0.5 - 1 ug/ml） 刺激24 小时.
方法4：人的PBMCs或者纯化的CD4＋细胞在包被人CD3抗体的培养板中，使用含有重组人的IL-2（10 ng/ml，目录号202-IL-010）和IL-4（10 ng/ml，目录号204-IL-005）的培养基培养两天；细胞洗涤后在含有重组人IL-2和IL-4的培养基中继续培养2天；最后收获细胞，使用PMA（10 ng/ml） 和Ionomycin （1 uM）刺激6小时20mL于Falcon管中，加入100mL激活后的全血（细胞浓度维持在2×106/mL） 混匀，室温暗处孵育15分钟；
方法5： CD4 T 细胞使用PHA （10 ng/ml） 刺激4 days
方法6： T 细胞使用抗CD3 的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1b （Lorre, et al., 1994， Clin Immuno Immunopath 70:1）
方法7： 使用PMA （50 ng/ml） 和Ionomycin （500 ng/ml）刺激
（10 ng/ml，目录号285-IF-100） 刺激2 小时，然后使用IFN（10 ng/ml） LPS（1 ug/ml）刺激22小时或者使用相同的方法刺激THP-1 细胞.g方法8： PBMCs细胞使用重组人IFN
方法9： EL4 在包被抗小鼠CD3抗体（25 ug/ml）的培养板中，使用抗CD28抗体（2 ug/ml） PMA（5ng/ml） Ionomycin（500 ng/ml） 刺激6小时
方法10：CD4＋T细胞在包被小鼠CD3（25ug/ ml）抗体的培养板中，使用含有抗小鼠的CD28（2 ug/ml）的抗体，重组小鼠的IL-2（10 ng/ml，目录号402-ML-020）和IL-4（50 ng/ml，目录号404-ML-005）的培养基培养两天；然后在含有重组小鼠IL-2和IL-4的培养基中继续培养3天；最后收获细胞，使用PMA（5 ng/ml）、Ionomycin（500 ng/ml）和monensin刺激6小时。
方法11： 小鼠ip巨噬细胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小时
方法12： 小鼠脾细胞使用PMA（5 ng/ml）和Ionomycin（500 ng/ml）刺激6小时
