磁珠法分离T细胞和B细胞
基 本 方 案 1 用 AUTOMACS 系 统 进行 总 T 细胞、 CD4 + 细 胞 或 CD8+T细胞的自动分离
材 料
小鼠
HBSS 洗涤缓冲液
基 本 方 案 2 使 用 AUTOMACS 系 统 进 行 B 细胞的自动分选
材 料
小鼠
HBSS 洗涤缓冲液
MACS 缓冲液
CD45R (B2 2 0 ) 磁 珠（Miltenyi)
RPMI-10 完全培养基
autoMACS 系 统 和 分 选 柱（Miltenyi)
30um 尼 龙 网（BD) 或 40/xm 预 分 离 滤 膜（Miltenyi)
1 . 用 2 只小鼠的脾脏制备单细胞悬液并去除红细胞（单 元 2.1)。
2.将细胞在 10 ml HBSS 洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数（附 录 3A)。
3.将细胞悬液在 4℃， 20og离心 10min。弃上清后将沉淀按每 108 个细胞 0.9ml MACS缓冲液的比例混悬。每 108 个细胞加入 0.1ml CD45R(B220) 磁珠后在 4℃孵育 15 min
4.按基本方案 1 中的步骤 4〜7 操作，这样 B 细胞将从阳性通道洗脱。
基 本 方 案 3 使 用 AUTOMACS 系统进行辅助细胞的自动分选
材 料
小鼠
HBSS 洗涤缓冲液
MACS 缓冲液
CD90 (Thyl.2 ) 磁 珠（Miltenyi)
RPMI-IO 完全培养基
autoMACS 系统和分选柱（Miltenyi)
30um 尼 龙 网（BD) 或 40um 预分离滤膜（Miltenyi)
1.用 2 只小鼠的脾脏制备单细胞悬液并去除红细胞（单元 2.1)。
2.将细胞在 IOml HBSS 洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数（附录 3A)。
3.将细胞悬液在 4°C， 200 g 离心 lOmin。弃上清后将沉淀按每 IO8 个细胞 0. 9 mlMACS缓冲液的比例混悬。每 1 〇 8 个细胞加入0.1ml CD90 (Thy1.2) 磁珠后在 4℃孵育 15 min
4.除了选择 depletes 程 序（非 possel 程序），其他操作按基本方案 1 中的步骤 4〜7 进行，这样辅助细胞将从阴性通道洗脱。
备 选 方 案 1 用磁性分选柱手工操作分离淋巴细胞
附 加 材 料（其 他 材 料 见 基 本 方 案 1 )
不含气体的 MACS 缓冲液， 4°C (在上样和洗柱过程中保持冰冷）
Midi MACS 分离磁铁、 MACS 多用支架、 LS 或 LD 分 选 （Miltenyi)
15 ml 离心管，无菌
la. 对于分离总 T 细胞， CD4+ T 细胞或 CD8+ T 细胞：按前述方法制备并标记单细胞悬 液（见基本方案 1， 1〜3 步）。
lb. 对于分离 B 细胞：按前述方法制备并标记单细胞悬液（见基本方案 2 , 步骤 1〜3)。
lc. 对于分离辅助细胞：按前述方法制备并标记单细胞悬液（见基本方案 3 , 步骤1〜3
2.将细胞悬液在 4°C， 200 g 离心 lOmin。
3.离心期间，将 Midi MACS 分离磁铁安装到 MACS 多用支架上，并将 LS 分选柱（用于分离总 T 细胞、 CD4+T 细胞、 CD8+T 细胞或 B 细胞）或 LD 柱（用于分离辅助细胞）放到磁体中，在分选柱下放一支无菌的 15 ml 离心管。用 4°C 不含气体的 MACS缓冲液冲洗分选柱 3 次，每次 3 ml。弃洗脱液，在分选柱下方放置一支干净的无菌离心管。
基 本 方 案 4 用 AUTOMACS 系统自动 分 选 CD4 +CD2 5+ 抑制性细胞
由此方法得到的阴性细胞（CD4+CD2 5- ) 可用作反应细胞或对照细胞。
备 选 方 案 2 用磁性分选柱手工操作分离 CD4 +CD25+抑制性细胞
附 加 材 料（其 他 材 料 见 基 本 方 案 4)
不含气体的 MACS 缓冲液， 4°C (在上样和洗柱过程中保持冰冷）
Midi MACS 分 离 磁 铁（Miltenyi)
MACS 多 用 支 架（Miltenyi)
LD 分 选 柱（Miltenyi)
-
会议会展
