关于PCR内参基因选择策略
关于内参基因的选择很多初级的实验人员很少会去思考这个问题，因为摆在面前的只有两种选择，β-actin和GAPDH，甚至在很多人长期的观念中对于内参的认知也仅仅停留在是一个表达量相对较高较稳定的看家基因，对于分子层面相对表达量的一个重要参照而已，至于为什么要选这两种，还有没有其他的内参，人们的回答往往是“Sorry，I don’t care.”或者“我的前辈就是这样用的，别的文献是这样写的，有问题吗？”。
有问题吗？BioTNT要在这里大声的疾呼“有，而且是很大的问题。”当人们检测某个基因的表达降低或者提高得出结果以后，你并不知道是它本身的表达量发生变化，还是因为样本量大小或者操作导致RNA的损失等其他原因导致的表达量变化，所以这个时候需要同时检测另外的基因作为参照。这另外的基因就是内参基因。
于是，从我们本身科学的要求来看，理想的内参就会有这样几个条件，1、表达量较大；2、稳定表达于不同类型的细胞和组织；3、表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；4、不受任何内源性或外源性因素的影响；5、不存在假基因，以避免基因组 DNA 的污染扩增。请注意这是理想的内参，让我们来一个一个看看我们常见的经典内参是不是真的够理想呢？
第一，是β-actin，即β肌动蛋白。我们先要来看看actin是什么，所谓的actin肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白，大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletal （骨骼）、cardiac （心）、smooth （平滑）muscle actin和γ-smooth muscle actin，其余两种广泛分布于各种组织中，包括 β -actin和γ-non-muscle actin。这些不同的亚型组织分布是不一样的，在肌肉组织中的beta-actin分布就很少，心肌主要是α-cardiac muscle actin。显而易见，如果我的研究模型是心或者是骨骼，β-actin作为内参显然就不合适。有研究表明，当细胞向恶性转化时，β-actin的mRNA的表达水平增加，很明显这与肿瘤细胞易增殖，会迁移的特性从理论上也对的起来，BioTNT在平时接触以肿瘤组织为样本的实验中，虽然已经控制了组织湿重，但是正常组和肿瘤组间的β-actin的表达差异还是相当大的，这又进一步限制了β-actin的适用范围，另外β-actin也是为数不多的几个要注意假基因污染的内参。随着对β-actin研究的深入，过去常被认为是表达稳定，表达量高的β肌动蛋白实际上并不那么稳定，包括一些肝组织的内脏组织中的β-actin也不是内参的最佳选择。
第二，是GAPDH。我们再来看下GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶，糖酵解过程中的一种反应酶，也是几乎在所有组织细胞中高表达，且表达量几乎不变，是细胞代谢途径中不可或缺的一个基因，但也正是因为其在糖酵解中扮演不可忽视的角色，导致了其被在牵涉到该代谢过程的所有内源和外源因素影响是及其明显的，比如，最最典型的细胞分裂时期的细胞，在不同细胞周期中GAPDH的表达呈显著性变化，因为同样原因，迅速分裂增殖的肿瘤细胞样本也是很难用GAPDH作为恒定表达内参来使用，还有在相关外源因素 (例如低氧、胰岛素、地塞米松、丝裂原、表皮生长因子等 )刺激下，GAPDH的mRNA表达水平也不同，这使得GAPDH在某些实验中还不如β-actin来的稳定。
现在，问题就非常明确了，过去我们曾非常依赖的两大内参或多或少甚至在某些地方存在着致命的缺陷，比如说肿瘤细胞的研究，似乎无法使用任何一种常规内参了，这如何去解决呢？所以BioTNT在这里将例举20中常用内参，并小解其中的一两个以作例证。
第三，18S rRNA 和 28S rRNA。由于 rRNA 是由一种不同于mRNA合成的RNA聚合酶所合成。因此rRNA合成的调节独立于mRNA，在影响mRNA表达的各种条件下，各种 r RNA水平很少发生变化，在肿瘤样本中，用rRNA作为内参也许是一个不错的选择。但是rRNA同时也存在着诸多问题，比如当对已纯化mRNA中的目标基因进行定量时，rRNA由于在纯化过程中被去除而不能用于标准化，再如，从结构上讲rRNA不包括poly(A)尾，所以从理论上讲在以oligo(dT)为引物的cDNA合成中不能被逆转录。但是说到这里，BioTNT也曾试过用oligo(dT)为引物逆转录rRNA，并且能够成功扩增出cDNA，且表达量并不低，所以BioTNT一直对于这点有困惑，但是就rRNA本身作为内参来使用这点，BioTNT还是小小推荐一下，在遇到样本量少，样本质量略低等等特殊情况，用rRNA作为内参相较还要优于β-actin和GAPDH。
第四，其他内参。有研究学者对67例肝组织研究, 发现UBC（泛素）和HMBS（胆色素原脱氨酶）对于肝组织的表达分析是最佳选择。在白血病、正常、恶性肿瘤中比较β-actin、β2-MG和PBGD （胆色素原脱氨酶），发现β2-MG最合适作为内参。PRKG1和TBP是适合于在B和T细胞及其肿瘤中控制RNA的质量和产量……。所以，不同的内参基因在不同的条件都有成为合适内参的潜能。在一组给定的标本或实验条件中, 平行测定2个或以上内参的表达量有助于发现和减小系统误差。
综上所述，当我们进一步对不同种类的看家基因进行内参筛选和研究的时候就会发现，内参世界比我们想象的要更为复杂，当我们所研究的对象从原核到真核，从细胞到组织，从正常到恶化，所有改变的条件对于我们内参的选择就是一次筛选，现实并不存在一种适合所有条件和样本类型的万能内参，BioTNT觉得以双内参或者甚至三内参、四内参进行实验从理论上讲更科学、更能减小误差。
就内参的进一步研究，BioTNT在这里就不一一展开了，实际上BioTNT在几年前就已经看到有国外做qPCR时选取4个内参作平均值得到的数据作为调整内参得到更可靠地修正值这一做法，证明已经有人意识到并且去试验这种更科学的做法，BioTNT虽只是一家之言，但也仅此希望能够有更多的人能够在实验前就已经认识到内参的重要性，并提前规避可能因为内参选择不当而导致后期实验数据没有意义的情况发生。
另，如果大家有感兴趣的，可以查找一些关于内参的大家的综述或论文。
来源：BioTNT（冠泰生物）
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标签： PCR内参基因
