非天然糖核苷酸的合成及其应用
尽管自然界中的碳水化合物和糖复合物结构十分复杂，但人的糖蛋白和糖脂仅有九种构成单元：葡萄糖（glucose, Glc）、半乳糖（galactose, Gal）、N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine, GlcNAc）、N-乙酰氨基半乳糖（N-acetylgalactosamine, GalNAc）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid, GlcA）、木糖（xylose, Xyl）、甘露糖（mannose, Man）、岩藻糖（fucose, Fuc）和N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac）（如图1）[1]。这些构成单元必须被活化为糖核苷酸后，才能参与到不同糖链的构建中[2, 3]。糖核苷酸在结构上可分为两类：核苷二磷酸（nucleoside diphosphate, NDP）糖和核苷一磷酸（nucleoside monophosphate, NMP）糖，其中NDP-糖最为常见。尿苷二磷酸（uridine diphosphate, UDP）单糖是最常见的NDP-糖供体，在多糖生物合成途径中，它们能够被糖基转移酶或者合酶转移到糖基受体上构建糖苷键。天然和非天然UDP-糖都能够通过化学、酶法和化学酶法来合成[4-7]。虽然已有很多文献报道了天然UDP-糖的合成方法，但是目前针对非天然UDP-糖的合成和应用的探索还相对匮乏。这些非天然糖基供体有很大的应用前景，可作为酶底物用于功能性多糖和糖复合物的合成、酶抑制剂研究以及各种活性测试[4, 8]。因此，非天然糖核苷酸的合成在过去十年间一直都是研究热点。Wagner等人总结了从1999年到2009年NDP-糖、NMP-糖及其衍生物的化学合成进展[4]，Thorson等人在2011年发表的有关糖基化的文章中详细总结了糖核苷酸的酶促合成途径（尤其是包括端基异构激酶和焦磷酸化酶的合成方法）及其底物和酶催化的转化[9]。这里，我们总结了非天然糖核苷酸，特别是尿苷二磷酸乙酰氨基葡萄糖（uridine diphosphate-N-acetylglucosamine, UDP-GlcNAc）/尿苷二磷酸乙酰氨基半乳糖（uridine diphosphate-N-acetylgalactosamine, UDP-GalNAc）类似物的化学法、酶促法和化学酶法制备方面的进展，及其在生理和药理学方面的生物技术应用。由于很难通过修饰天然糖核苷酸来获得非天然糖核苷酸[4]，目前研究中主要由“两步法”合成策略来实现非天然糖基供体的合成：第一步是糖-1-磷酸（sugar-1-P）的合成，可以在此阶段实现结构的衍生化；第二步是二磷酸键的形成。同时，我们也介绍了糖核苷酸在过去十年中的新应用，包括碳链长度可控多糖的合成，稳定的同位素标记技术，酶促和代谢生物正交策略以及结构-活性关系（structure activity relationships, SAR）研究等。
1
糖核苷酸的合成
常见的糖核苷酸中的大多数共有相似的生物合成途径，即由6-磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖作为关键中间体，以激酶和核苷酸转移酶作为关键酶。GlcNAc和GalNAc是很多重要多糖或糖复合物（比如糖胺聚糖（glycosaminoglycans, GAGs））的基本构成单元，所以对它们相应的核苷酸供体（即UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc）的研究最为广泛[10,11]。在生物合成途径中，通常是由酶催化葡萄糖（de novo
pathway）或GlcNAc/GalNAc（salvage pathways）生成糖环1-位单磷酸化的中间产物GlcNAc-1-磷酸（GlcNAc-1-P），再对GlcNAc-1-P进行酶促焦磷酸化从而合成二磷酸供体UDP-GlcNAc[12]。UDP-GlcNAc/GalNAc的生物合成也可被进一步简化：用6-激酶将糖转化为的糖-6-P，糖-6-P再经变位酶转化为糖-1-P，糖-1-P紧接着被尿苷三磷酸（UTP）焦磷酸化得到UDP-糖（如图2）[5]。
根据生物合成途径得知，核苷二磷酸糖合成的关键步骤是在核苷的5'-OH位和糖的异头羟基之间引入焦磷酸基团（如图3）[4]。目前研究中常用两种途径进行合成，第一种方法是将含离去基团的糖基供体（如卤化物）和核苷5'-二磷酸直接进行糖基化（如图3，path A）。但这种方法较难控制糖苷键的立体选择性。第二种方法是Khorana和Moffat开发的，目前更流行（如图3，path B）：耦合单糖-1-磷酸和活化的核苷5'-单磷酸盐（如核苷磷酸吗啡酸盐）来构建焦磷酸键，最终产物的糖苷键构型可以通过糖-1-磷酸的立体选择性来控制[13,14]。
1.1
α-连接构型的糖-1-磷酸的合成
一般而言，控制糖-1-P的立体构型，再将其与活化的核苷5'-单磷酸酯偶联，可以控制UDP-糖基供体糖环和焦磷酸部分之间的糖苷键构型。到目前为止，对α-连接构型的糖-1-磷酸的合成方法的研究较为深入。
1.1.1
麦克唐纳反应（MacDonald reaction）
麦克唐纳反应是一种用于糖的单磷酸化的经典方法，反应过程是全乙酰基保护的单糖与磷酸在真空下进行的化学反应，以高选择性生成α-连接构型的糖-1-磷酸[15]。在这个反应的基础上，Masuko等人以30%-50%的产率构建了一个小型非天然GlcNAc-1-P和GlcNAc-1-P衍生物库（如图4）[16]。他们也证实了叠氮基和炔基在这种酸性条件下较稳定，因此，可以进一步通过点击化学反应进行荧光基团标记。UDP-三氟乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNTFA）是在化学酶法合成硫酸乙酰肝素和肝素中一种常用的糖基供体，而在麦克唐纳反应的条件下三氟乙酰氨基也很稳定，所以也可以利用该反应合成α-连接构型GlcNTFA-1-P[17]。该方法也可用于其他糖核苷酸的合成，如α-D-阿拉伯呋喃糖-1-磷酸（α-D-arabinofuranose-1-phosphate, Ara-1-P）[18]、3-脱氧-α-D-阿拉伯己糖-1-磷酸[19]和2-脱氧-α-D-葡萄糖-1-磷酸[19]。然而，麦克唐纳反应的反应条件较为苛刻，一般不适用于热稳定性差的糖的合成，而且其产率普遍偏低，这限制了该方法进一步的应用[4]。
1.1.2
对半缩醛羟基进行磷酸化反应
对糖环半缩醛羟基C-1-OH直接进行磷酸化是另一种构建α-构型糖-1-P的有效方法。半缩醛羟基和磷酸化试剂反应后能获得保护基保护的α-构型单磷酸，然后经过催化加氢即可将磷酸盐上的保护基团去除，获得α-连接构型糖-1-P。Sabesan和Neira等人通过4-二甲基氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine, DMAP）催化糖半缩醛和二苯基膦酰氯耦合构建了α-糖苷键[20]。Dinev等人用同样方法制备了13C标记的全乙酰化葡萄糖-1-磷酸，其产率为83%(如图5-I)[21]。Schultz等人在二异丙基氨基锂（lithium diisopropylamide, LDA）存在下用四苄基焦磷酸进行磷酸化，生成了高α-选择性的磷酸化产物（如图5-II）[22,23]。他们发现氟、叠氮基在这种条件下也很稳定，从而可以构建氟、叠氮基修饰的非天然糖基供体。Feng等人（如图5-III）通过三氮唑催化二苄基二乙基胺基膦（dibenzyl
N,N-diethylphosphoramidite, DDP）与半缩醛，生成亚磷酸盐，随后氧化得到糖-1-P。虽然此反应没有立体选择性，产物为α，β混合物（α:β=1:1）[24]，但后续在四氢呋喃中用叔丁基过氧化氢（t-BuOOH）处理这两种异构体时，β-构型的产物能快速异构化为α-异构体。但是，在选择氧化剂时，如果使用过氧化氢（H2O2），会破坏O-P键生成副产物。同样，Graziani等用双（苄氧基）-N，N-二异丙基氨基-磷化氢/1H-四唑成功合成了GDP-D-甘油-α-D-甘露庚糖，然后用叔丁基过氧化氢（tert-Butyl hydroperoxide, TBHP）氧化制备了关键的中间体α-磷酸盐[25]。该方法还可用于合成一系列糖-1-磷酸酯，例如D-甘露糖醛酸（D-mannuronic acid, ManA）-1-P[26]，N-乙酰基尿酸（N-acetylmuramic acid，
MurNAc）-1-P[27]，2-脱氧-α-D-葡萄糖-1-P，3-脱氧-α-D-阿拉伯己糖-1-P,
α-D-来苏糖-1-P和4-脱氧-α-D-lyxo-hexose-1-P[19]。
1.1.3
酶法途径
由于糖核苷酸在有机溶剂中的溶解度较低，且糖苷键和焦磷酸键不耐水解，通过传统化学方法合成糖核苷酸非常具有挑战性。另外，在化学合成过程中通常涉及多步的保护基操作和异构体分离纯化，其过程繁琐、产率低下。而酶法合成利用了酶催化的高效选择性，能够模拟糖苷键生物合成途径，具有高立体选择性和高区域选择性，有广泛的应用前景[5]。NahK（N-acetylhexosamine kinase）是一种N-乙酰己糖胺激酶，也是第一个被报道的野生型葡萄糖型1-激酶，可以快速有效地催化GlcNAc受体和5'-三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）磷酸供体合成GlcNAc-1-P[28]。Zhao和Cai等人利用这种酶成功将非天然的GlcNAc/GalNAc类似物转换成了它们的1-磷酸化产物。并且他们发现这种酶的底物适用性非常好，无论糖环的C-4位羟基是平伏键或竖立键，都不影响酶对底物的识别（如图6）[29,30]。更重要的是，对糖底物的N-酰基进行多种正交基团的修饰，也不影响酶的识别。因此，通过此方法可以成功将一些正交基团标记到糖或糖复合物结构中去，便于进一步进行生物活性研究。另外，NahK可以与其他两种酶（Pasteurella multocida
N-acetylglucosamine 1-phosphate uridylyltransferasepm, PmGlmU和Pasteurella multocida
inorganic pyrophosphatase, PmPpA）结合使用，从而“一锅法”合成UDP糖衍生物，大大简化了合成过程[31]。
1.2
β-键构型的糖-1-磷酸的合成由于糖环端基的异构效应，相比α-构型，β-构型的吡喃糖磷酸很不稳定，所以其合成颇具挑战性。前面介绍的方法都无法实现β-构型的构建，目前也很少有文献报导β-键构型的糖-1-磷酸的合成。Oberthür等人利用α-构型糖基卤化物和四丁胺盐之间的SN2取代反应合成了β-构型2-脱氧糖磷酸(如图7-I)[32]。他们发现，更稳定的异头离去基团有助于磷酸化反应从SN1转换为SN2路径。同时，邻近基团的参与有助于磷酸化步骤中的立体控制。Timmons等人通过乙酰基或苯甲酰基保护的糖基溴化物和磷酸二苄酯的偶联，成功合成了β-L-岩藻糖/鼠李糖-1-磷酸(如图7-II)[33]。
Prihar等人用邻亚苯基氯膦酸将甘露吡喃糖的半缩醛羟基磷酸化，得到β-D-甘露吡喃糖基-1-P[34]。同时，他们还使用MacDonald反应获得了β-和α-L-岩藻呋喃糖-1-磷酸的混合物（β:α=12:5）[35]。此外，酶促途径也可以实现β-构型糖-1-P的合成，如Stiller等人使用岩藻糖激酶合成了β-L-岩藻糖-1-P[36]。
1.3
二磷酸键的构建
1.3.1
化学法
在化学法构建二磷酸键过程中，使用催化剂或各种活性核苷磷酸吗啡啉酸酯，可以改善从糖-1-P转化为UDP糖的反应时间和收率。例如，磷酸和尿苷-单磷酸吗啡啉盐在吡啶中的偶联效率很有限[25]，引入催化剂1H-四唑后则能显著加快反应效率(如图8-I)，而uridine 5′-monophosphomorpholidate 4-morpholine-N,N-dicyclohexylcarboxamidine salt是在生产UDP-糖过程中最常见的活性单磷酸吗啡啉盐试剂[22]。此外，一锅法也能有效提高得率，Gold等人基于糖磷酸盐和核苷亚磷酰胺的耦合，同步原位完成了活化、氧化和去保护，快速合成了UDP-N-乙酰氨基己糖衍生物。其中，中间产物中的亚磷酸基团可直接被t-BuOOH氧化成磷酸基，从而生成目标供体(如图8-II)[37]。除了UDP-GlcNAc /GalNAc外，化学途径还可以实现其他糖核苷酸的合成，如UDP-4-脱氧-α-D-木糖吡喃糖（UDP-D-Glc）[38]、UDP-N-乙酰胞壁酸[27]、UDP-D-岩藻糖[39]以及GDP-D-ManA[26]。
1.3.2
酶法和化学酶法
焦磷酸化酶通常用于连接一个糖基磷酸和一个核苷单磷酸形成UDP糖。例如，GlcNAc-1-P双转移酶（GlcNAc-1-P uridyltranferase,
GlmU）能够催化糖-1-P和UTP反应来合成非天然UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc糖基供体[40]。同时，在催化过程中加入酵母无机焦磷酸酶可以降解副产物焦磷酸盐（PPi），推动反应向有利方向进行（如图9-I）[41]。Guan等人结合化学和酶法合成了一系列非天然UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc类似物，这些衍生物含有多种可以进行生物正交反应的官能团，所以可用多种生物正交反应来方便地修饰基团（特别是对C-2-氮-位上的官能团的修饰），组成非天然核苷酸糖数据库（如图9-I）[41]。虽然底物中C-2-氮-位上的酰胺键是被GlmU识别的必须基团[16]，但Guan等人发现修饰糖环的N-乙酰基、C-3、C-4、C-6等位置后，糖环仍然可以被GlmU识别，从而生成非天然糖基供体。并且，当C4位取代基更小时，酶催化效率更高[41]。因为GlcNAc/GalNAc的C-4位羟基活性较低，所以可以首先选择性保护其他邻近位点的羟基，进而能够对C-4位进行修饰，合成非天然GlcNAc/GalNAc衍生物[42]。据此，Zhang和Schultz等人研究了C-4位的非天然修饰(如图9-II)[22, 23]。他们发现4-OH基团上的修饰不影响GlmU的识别，故合成了4F GlcNAc-1-P和4F GalNAc-1-P，随后这两种非天然糖-1-P成功地在GlmU催化下与UTP反应构建了二磷酸键。这种构建二磷酸键的方法的得率很高，与化学合成的方法收率接近，远超过利用大肠杆菌JM109菌株（E. coli
JM109）的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶的合成方法[24]。但是，研究人员也发现，GlmU不能识别4N3
N-乙酰氨基己糖-1-磷酸，其原因可能是叠氮基较大。
