药品质量标准分析方法验证
一、背景知识
药品质量标准分析方法验证的目的是证明采用的方法适合于相应的检测要求,在建立药品质量标准时,分析方法需经验证;在药品生产工艺变更、制剂的组分改变、原分析方法进行修订时,质量标准分析方法也需要进行验证,该验证过程亦被称为方法再验证,方法再验证的内容可以是全面验证或是部分验证。方法再验证理由、过程和结果均应记载在药品标准起草或修订说明中。
需验证的分析项目有:鉴别试验,杂质定量或限度检查,原料药或制剂中有效成分含量测定,以及制剂中有效成分含量测定,以及制剂中其他成分(如防腐剂等)的测定。药品溶出度、释放度等检查中,其溶出量等的测试方法也应作必要验证。验证内容有:准确度、精密度(包括重复性、中间精密度和重现性)、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。视具体方法,拟定需要验证的内容。
二、知识储备
1、准确度
准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度,一般用回收率(%)表示。准确度应在规定的范围内测试。
(1)含量在测定方法的准确度
①原料药的含量测定
可用已知纯度的对照品或供试品进行测定,并按下式计算回收率;或用本法所得的结果与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较。
如该分析方法已经测试并求得精密度、线性和专属性,在准确度无法直接测试(采用对照品对照法计算含量的方法,如高效液相色谱法)或可推算出的情况下,该项目可不再进行验证。
②制剂的含量测定
主要测试制剂中其他组分及辅料对含量测定方法的影响。可用含已知量被测物的制剂各组分混合物(包括制剂辅料)进行测定,回收率的计算同原料药的含量测定。如不能获得制剂的全部组分,则可向制剂中加入已知量的被测物进行测定,回收率则应按下式计算;或用本法所得的结果与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较。
(2)杂质定量测定方法的准确度
杂质定量测定方法多采用色谱法,其准确度可通过向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测试。如不能获得杂质或降解产物,可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较,如药典标准方法或经过验证的方法。在不能测得杂质或降解产物的响应因子或不能测得其对原料药的相对响应因子的情况下,可用原料药的响应因子。同时,应明确表示单个杂质和杂质总量相当于主成分的重量比(%)或面积比(%)。
(3)数据要求
在规定范围内,至少用9个测定结果进行评价。例如,设计3个不同浓度,每个浓度各制备3份供试品溶液,进行测定。比如一般要求分别配制浓度为80%、100%和120%的供试品溶液各3份,分别测定其含量,将实测值与论值比较,计算回收率。应报告已知加入量的回收率(%),或测定结果的平均值与真实值之差及其相对标准偏差或可信限。
2.精密度
精密度系指在规定的测试条件下,同一个均匀供试品,经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用标准偏差(standard deviation,s或SD)或者相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)表示,其计算式如下。
精密度是考察分析方法在不同时间、由不同人员操作,或在不同的实验室所获得的结果重复性或重现性。涉及定量测定的项目,如含量测定和杂质定量测定均应验证方法的精密度。
(1)验证内容
精密度验证内容包括重复性、中间精密度和重现性。
①重复性
在较短的时间间隔内,在相同的操作条件下,由同一分析人员连续测定所得结果的精密度称为重复性,也称批内精密度或日内精密度。
在规定“范围”内,至少用9个测定结果进行评价。例如,制备3个不同浓度的样品,每个浓度分别制备3份供试品进行测定;或将相当于100%水平的供试品溶液,用至少测定6次的结果进行评价。
②中间精密度
在同一个实验室,由于实验室内部条件的改变,如不同时间不同分析人员用不同设备测定所得结果之间的精密度,称为中间精密度。其中,由不同分析人员用同一设备测定所得结果的中间精密度通常称为批间精密度或日间精密度。
为考察随机变动因素对精密度的影响,应设计方案进行中间精密度试验。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备。
③重现性
在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度,称为重现性。
法定标准采用的分析方法应进行重现性试验。如建立药典分析方法时通过协同检验得出重现性结果,协同检验的目的、过程和重现性结果均应记载在起草说明中,应注意重现性试验用样品本身的质量均匀性和贮存运输中的环境因素,以免影响重现性结果。
(2)数据要求
精密度验证中所测数据均应报告标准偏差相对标准偏差和可信限。
3.专属性
专属性系指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下,采用的方法能正确测定出被测物的特征。鉴别反应、杂质检查和含量测定的方法,均应考察其专属性。如方法不够专属,应采用多个方法予以补充。
(1)鉴别反应
应能与可能共存的物质或与结构相似化合物区分,不含被测成分的供试品,以及结构相似或组分中的有关化合物,均应呈负反应。
(2)含量测定和杂质测定
色谱法和其他分离方法应附代表性图谱,以说明方法的专属性,并应表明诸成分在图中的位置,色谱法中的分离度应符合要求。
在杂质可获得情况下,对于含量测定,试样中可加入杂质或辅料,考察测定结果是否受干扰,并可与未加杂质和辅料的试样比较测定结果;对于杂质测定,也可向试样中加入一定量的杂质,考察杂质之间能否得到分离。
在杂质或降解产物不能获得的情况下,可将含有杂志或降解产物的试样进行测定,与另一个经验证了的方法或药典方法比较结果;用强光照射、高温、高湿、酸(碱)水解或氧化的方法进行加速破坏,以研究可能的降解物质及其降解途径,含量测底方法应比对二法的结果,杂质检查应比对检出的杂质个数,必要时可采用光二极管阵列检测和质谱检测,进行纯度检查。
4.检测限
检测限(limit of detection,LOD)是指试样中被测物能检测出的最低浓度或量。LOD是一种限度检验效能指标,它反映方法是否具有灵敏的检测能力,即是否具备足够的灵敏度。它无需准确定量,只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可,药品的鉴别试验和杂质检查方法均应通过测试确定方法的检测限。
(1)常用的方法
①目视法
用已知浓度的被测物,通过目视法试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。本法适用于可用目视法直接评价结果的分析方法,通常为非仪器分析法,如鉴别试验的显色法、杂质检查的薄层色谱法(TLC)等。
②信噪比法
用已知低浓度试样测出信号与空白样品测出的信号(基线噪声)进行比较,计算出能被可靠地检测出的最低浓度或量,一般以信噪比(S/N)3:1或2:1时的相应浓度或注入仪器的量确定LOD值。本法适用于能直观显示信号与基线噪声水平(强度)的仪器分析方法。
③标准偏差法
用空白样品进行分析,求其背景响应值的标准偏差S空,再将3倍空白标准偏差作为检测限的估算值。本法适用于不能直观比较信噪比的仪器分析方法,如紫外分光光度法。计算得到的LOD值与实际测得的LOD值相一致,可按下式进行校正。
式中,f为校正因数(系将吸光度值单位转换为浓度单位);C样为低浓度样品溶液的浓度值;A样为低浓度样品溶液的吸光度值。
(2)数据要求
无论用何种方法,均应用一定数量(如6份)的试样,其浓度为近于或等于检测限目标值,进行分析,以可靠地测定检测限,检测限的数据应附测试图谱,说明测试过程和检测限结果。
5.定量限
定量限(limit of quantitation,LOQ)系指试样中被测物质能被定量测定的最低量,其测定结果应具有一定准确度和精确度,LOQ体现分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。杂质和降解产物用定量测定方法研究时,应确定方法的LOQ。
LOQ的测定方法与LOD测定方法相同,只是相应的系数(倍数)不同,因为有关物质定量测定通常选用HPLC法,所以LOQ的确定常用信噪比法,可通过不同浓度(在低浓度区)的试样测定响应信号后,计算信噪比法S/N=10时的相应浓度或注入仪器的量确定定量限。
数据要求:附测试图谱,并说明测试过程和定量限,以及测试结果的准确度与精密度。
6.线性
线性系指在设计的“范围”内,测试结果(响应值)与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度,线性是定量测定的基础,涉及定量测定的项目,如含量测定和杂质定量检查均需验证线性。
应在规定的“范围”内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释,或分别精密称样,制备一系列(至少5份)供试样品的方法进行测定。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图,观察是否呈线性,再用最小二乘法进行线性回归。必要时,响应信号可经数学转换,再用线性回归计算。
数据要求:应列出回归方程、相关系数和线性图。
7.范围
范围系指能达到一定精密度、准确度和限性、测试方法适用的高低限浓度或量的区间。范围是规定值,应在试验研究开始前确定验证的范围和试验方法。可以采用符合要求的原料药配制成不同的浓度,按照相应的测定方法进行试验。
涉及定量测定的检测项目均需要对范围进行验证,如含量测定、含量均匀度、溶出度或释放度,以及特殊元素或特殊杂质的定量检查等。
范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果和要求确定。
(1)原料药和制剂含量测定
范围应为测试浓度的80%～120%。
(2)制剂含量均匀度检查
范围应为测试浓度的70%～130%,根据剂型特点,如气雾剂和喷雾剂,范围可适当放宽。
(3)溶出度或释放度中的溶出量测定
范围应为限度值的±20%,如规定了限度范围,则应为下限的-20%至上限的+20%。如规定了数个限度范围,则应为最低下限的-20%至最高上限的+20%。
(4)特殊元素含量测定范围
范围应为限度值的±20%,如规定了限度范围,则应为下限的-20%至上限的+20%。
(5)杂质测定
范围应根据初步实测,拟定为规定限度的±20%。如果杂质检查与量测定同时进行,且用峰面积按百分归一化法计算,则线性范围应为杂质规定限度的一20%至含量限度(或上限)的+20%。
8.耐用性
耐用性系指在测定条件有小的变动时,测定结果不受影响的承受程度。耐用性表明测定结果的偏差在可接受范围内,测定条件的最大允许变动范围。为使分析方法可为常规检验提供依据,开始研究分析方法时,就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻,则应在方法中写明。
典型的变动因素有:被测溶液的稳定性,样品提取次数、时间等。液相色谱法中的典型变动因素有:流动相的组成比例和pH值、不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱、柱温、流速等。气相液相色谱法变动因素有:不同厂牌或批号的色谱柱、固定相、不同类型的担体、主温、进样口和检测器温度等。
经试验,应说明小的变动能否通过设计的系统实用性试验,以确保方法有效。
