| 实验步骤 |
材料：
缓冲液和溶液：
碱裂解液 I：
50 mmol/L 葡萄糖
25 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）
10 mmol/L EDTA（pH8.0）
（溶液 I 一次可配制 100 ml，在 15psi[1.05 kg/cm2] 压力下蒸汽灭菌 15 min，保存于 4 摄氏度。）
碱裂解液 II：
0.2 N NaOH（从 10N 贮存液中现用稀释）
1%（m/V）SDS
（溶液 II 要现用现配，室温 下使用）
碱裂解液 III：
5mol/L 乙酸钾 60 ml
冰乙酸 11.5 ml
双蒸水（去离子水）28.5 ml
所配成的溶液中钾的浓度为 3mol/L，乙酸根的浓度为 5mol/L。保存于 4 摄氏度，用时置于冰浴中。）
另需：
乙醇
异丙醇
STE
TE（pH8.0）
溶菌酶（10 mg/ml）
现在开始实验：
细胞的制备：
1. 挑取转化 细菌的单菌落，接种到 30 ml 含适当抗生素的培养基中。
注：
a. 试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大 4 倍。
b. 试管不宜盖的太紧
c. 应在剧烈振摇下温育
2. 在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚期（OD600 约为 0.6）。
3. 在含 500 mlLB、YT 或 Terrific 培养液（预热到 37 摄氏度）及适当抗生素的烧瓶（2L）中接种 25 ml 对数生长期晚期的菌液，将此培养液在 37 摄氏度剧烈振摇（300r/min）培养约 2.5 小时。
注：最后菌液的 OD600 值应为 0.4。由于不同菌株的生长速度不同，可稍微延长或缩短 培养时间，使最终的 OD 值为 0.4。
4. 若质粒为低或中拷贝数的松弛型质粒，在培养液中添加 2.5 ml 浓度为 34 mg/ml 的氯霉素，使其终浓度为 170 微克/ml。
注：对于高拷贝数的质粒不需要添加氯霉素。
5. 于 37 摄氏度，以 300r/min 剧烈振荡再培养 12~16 h。
6. 取部分菌液（1~2 ml）到离心管中，4 摄氏度储存。于 4 摄氏度，以 2700 g 离心 15 min 以收集余下的近 500 ml 培养物。弃上清，倒置离心管使残余的上清流出。
7. 用 200 ml 冰预冷的 STE 重悬细菌沉淀，按步骤 6 所述重新收集细菌并贮存于零下 20 摄氏度。
8. 用步骤 6 中贮存的 1~2 ml 菌液提取质粒，采用酶切和琼脂糖电泳分析此小量制备质粒，以确定大量培养菌液中正确的质粒已得到扩增。
注：设置这种对照可能看上去有点过于谨慎，然而它可以避免发生某些可能难以挽回、浪费大量时间的错误。
9、将步骤 7 中冻存的细菌在室温下放置 5~10 min 使其解冻后， 用 18 ml（10 ml）碱裂解液 I 重悬。
注：只有步骤 4 中使用了氯霉素的菌液才应参照括号中的体积数。
10、加 2 ml（1 ml）新配置的 10 mg/ml 溶菌酶。
11、加 40 ml（20 ml）新配置的碱裂解液 II。盖上离心管盖，轻轻颠倒数次，彻底混匀，室温下放置 5~10 min。
注：延长超螺旋 DNA 暴露于碱的时间会使其不可逆变性，所产生的环状卷曲 DNA 不能被限制酶内切，而且它在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率为正常超螺旋 DNA 的两倍，难以被溴化乙锭染色。从细菌中用碱裂解法提取质粒时可能 会看到微量的这种 DNA。
12. 加 20 ml（15 ml）冰预冷的碱裂解液 III。盖上离心管盖，轻轻地但完全地振荡混匀几次（此时应不再有分离的两个液相）。 将离心管在冰上放置 10 min。
注：在放置过程中会出现由染色体 DNA、高分子量 RNA、钾离子/SDS/蛋白质/细胞壁复合物一起形成的乳白色沉淀。在碱裂解液 III 中最好使用醋酸钾而非醋酸钠，因为十二烷基硫酸钾盐远比钠盐难溶。
13. 在 4 摄氏度 20，000 g 离心碱裂解液 30 min，无须制动，让转头自然停止。 将上清轻轻移入量筒中，弃去离心管中的沉淀。
注：不能形成紧密沉淀的原因常常是加入裂解液 II 时混匀不充分。如果细菌碎片不能形成紧密的沉淀，以 20,000 g 再次离心 15 min，然后将上清尽量移入干净的离心管中。转移的时候使用四层纱布过滤上清可以除去黏稠的基因组 DNA 和蛋白质沉淀残余。
质粒 DNA 的回收：
14. 量取上清的体积，将其连同 0.6 倍体积的异丙醇一起移入一只洁净离心管中并将其充分混匀，室温下放置 10 min。
15. 在室温下以 12,000 g 离心 15 min 回收核酸沉淀。
注：若在 4 摄氏度下离心会使盐也沉淀下来。
16. 小心弃去上清，将离心管敞开盖，倒置于纸巾上以除去残余的上清。在室温下用 70% 的宜春涮洗管底及管壁，倒掉乙醇，并用与真空管道相连的巴斯德吸管除去附于管壁的液滴。将离心管开口倒置于纸巾上使剩余的乙醇挥发掉。
注：如果用于干燥器或真空干燥的方法干燥 DNA 沉淀，在某些情况下它会变得难以溶解并且可能变性。将沉淀在室温下干燥 10~15 min 对于乙醇挥发来说是足够了，而且不会引起 DNA 脱水。
17. 用 3 ml TE（pH8.0）溶解湿润的核酸沉淀。
18. 粗制质粒 DNA 的纯化可用柱层析法，聚乙二醇沉淀法或 CsCl-溴化乙锭梯度离心法。
19. 用限制酶酶切及凝胶电泳分析确证质粒的结构。
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